拟南芥ABA诱导侧根减少突变体的筛选与基因克隆

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侧根作为拟南芥胚后发育的重要器官,在拟南芥根构型建立中起着重要的作用。尽管植物自身营养水平及外界生物、非生物环境条件对侧根的发生都有影响,但是目前对这些因素特别是ABA(脱落酸)影响植物侧根生成的分子机理还知之甚少。因此对ABA调控侧根发育的分子机理研究及关键基因的克隆意义重大。本研究是在设定ABA胁迫条件下对侧根形成和发育相关突变体进行筛选,经过大量的筛选,得到表型比较稳定的与ABA调控根构型有关的突变体4种。本文着重研究了其中1个T-DNA插入突变体,该突变体在ABA胁迫条件下侧根少于野生型(该突变体命名为raa2-1)。通过TAIL-PCR方法,我们得知了RAA2基因的信息,同时我们从salk种子库上查到了该基因的另一个T-DNA插入的突变体材料,并要到了该突变体,命名为raa2-2。   通过对突变体表型、遗传分析以及基因克隆和简单的功能分析,我们得到以下主要研究结果:(1)通过对280种T-DNA插入突变体(左建儒实验室惠赠)和40种EMS诱变的突变体(实验室提供),进行在设定ABA胁迫条件下筛选,最终得到表型比较稳定的与ABA调控根构型有关的突变体4种,分别是t237,t245,e28,e45。在MS(含1.2%琼脂)培养基上,这四种突变体的表型都表现为与野生型无明显差异;在含5μMABA的MS(含1.2%琼脂)培养基上,这四种突变体的侧根数量都要比野生型(WT)Columbia(Col-0)的侧根数量少。(2)RAA2功能缺失突变导致在外源5μMABA存在的条件下,突变体侧根的形成受ABA抑制程度更大。用不同种类、不同浓度的糖处理突变体,它们的根系表型与野生型的根系表型则没有明显差异。(3)0.5μMABA和1μMABA处理的萌发实验显示,突变体的萌发率比野生型的萌发率低,它们对ABA更敏感。失水和红外实验显示,突变体的气孔开度比野生型的气孔开度大。(4)遗传分析表明,突变体为单基因隐形突变。利用TAIL-PCR方法克隆了RAA2基因。RAA2基因定位在第1条染色体上。对基因进行生物信息学分析得知其所编码的蛋白是一个具有多个跨膜结构域的膜蛋白,该膜蛋白属于LrgB-like家族,且与细菌中的lrgAB操纵子同源,都具有两个保守结构域LrgA和LrgB,目前该膜蛋白功能未知。突变体raa2-1,其T-DNA插入位点位于第二个外显子内。突变体raa2-2,其T-DNA插入位点位于第一个内含子内。(5)对RAA2基因的转录水平进行分析,结果显示两个突变体中RAA2基因均被敲除。同时我们构建了该基因的回补载体和超表达载体,以便进一步了解RAA2基因的功能。   综合上述结果,我们认为ABA调控根构型的信号转导过程是非常复杂的信号途径,其作用机制可能与糖信号没有关系。同时发现该基因可能参与ABA调控的其它信号途径。另外,构建RAA2基因的回补载体和超表达载体,为进一步了解RAA2基因的功能做好基础工作。拟南芥
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