论文部分内容阅读
背景与目的弥漫性轴索损伤（Diffuse axonal injury,DAI）是在头部受到外力作用后发生的,以神经轴索损伤为主要改变的一种弥漫性、闭合性的原发性脑实质损伤。DAI缺乏早期诊断标准,且无特异治疗方法,多数患者通常伤情较重,治疗困难,死亡率高,预后差。而且,在法医学鉴定中,由于轴索的损伤容易被忽视而易发生漏诊。因而深入探究DAI发生的病理生理机制,对于临床诊疗以及法医学鉴定都有借鉴意义。普遍认为DAI的发生是在外力的影响下使头部产生加速、减速运动而产生不同大小、不同方向的剪切力的作用,引发一系列生化反应,而最终导致细胞骨架破坏、神经轴索损伤以及神经元的死亡。因此,轴索损伤通常不是由外力直接引发,而是一种迟发性损伤,期间包含了力信号与生化信号之间的转导,研究显示力信号转导最主要的途径有2种,一种是力敏感受体途径,其中整合素被认为是关键的力敏感受体,另一种是机械敏感离子通道途径。整合素（Integrin）是一类对机械力敏感的受体,属于粘附因子家族,存在于所有组织中,能感受到来自细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的力信号并将其传入胞内。另一类与机械力转导关系密切的是瞬时受体电位TRP通道（Transient Receptor Potential Channels,TRP）,其中TRPC在神经系统中广泛表达,能影响神经元内Ca2+浓度。然而,整合素和TRPC参与DAI的机制仍有许多环节需要研究清楚。本研究的目的是:（1）研究整合素在机械力导致神经元损伤中的表达与作用,探讨其在DAI后细胞骨架损伤中的机制;（2）研究TRPC通道在机械力导致神经元损伤中的作用及可能机制。方法1.第一部分:（1）建立神经元机械力损伤模型:取SD乳鼠皮层神经元进行培养,待第7天神经元生长稳定,随机分为对照组,损伤组以及RGD肽（整合素拮抗剂）干预组。对照组不做处理,RGD肽干预组在进行力加载前先用药物干预培养,并与损伤组同时加力致伤,体外模拟DAI过程,损伤后观察神经元形态。（2）利用免疫荧光方法明确整合素以及黏附斑激酶在神经元内的表达。（3）Western blot法检测外力致神经元损伤中整合素β1以及黏附斑激酶FAK的表达情况。（4）免疫荧光方法检测整合素对外力致神经元损伤中细胞骨架的影响。2.第二部分:（1）建立神经元机械力损伤模型同第一部分,随机分为对照组,损伤组以及SKF（TRPC通道阻断剂）干预组。对照组不做处理,SKF干预组在进行力加载前先用药物干预培养,并与损伤组同时加力致伤,体外模拟DAI过程,损伤后检测神经元内钙离子浓度的变化。（2）免疫荧光方法检测TRPC通道在外力致神经元损伤后细胞骨架蛋白NF-L及其与Ca MKⅡ的共定位情况。（3）流式细胞学方法检测TRPC通道在外力致神经元损伤后神经元的凋亡情况。结果1.第一部分:（1）本实验设置神经元机械力损伤模型参数为:弹力膜形变量10mm,形变时间1.5s,对弹力膜上培养稳定的神经元进行牵拉后,发现神经元轴索弯曲,波浪样变,甚至呈“S”型,随着时间延长,可见末端收缩球的形成,伴有神经元死亡,轴索数量减少,形态不清。（2）培养第7天的神经元生长良好,检测到整合素β1（+）且FAK（+）,可以开展后续实验。（3）相对于对照组,损伤组的FAK表达上调（p＜0.05）,而整合素β1的表达没有明显改变。（4）与对照组相比,损伤组神经元的NF-L荧光强度增强,而RGD干预组NFL荧光强度较损伤组减弱;损伤后α-tubulin的荧光强度较对照组减弱,但RGD干预组的α-tubulin荧光强度较损伤组有所增强。2.第二部分:（1）利用时间连续性模式,用免疫荧光方法检测到加力后神经元内钙荧光强度上升,但加入SKF干预的神经元细胞内钙荧光强度较损伤组降低。（2）对细胞加力致伤后,损伤组的NF-L荧光强度较对照组增强,而SKF干预组的NF-L荧光强度弱于损伤组。损伤后,NF-L与Ca MKII的重叠系数持续降低,而加入SKF干预后的神经元内重叠系数明显高于损伤组的。（3）就凋亡细胞而言,与对照组相比,SKF干预之后凋亡比例在总体上有所降低,尤其在伤后12h差异最为明显,而对活细胞没有明显影响。结论1.第一部分:弥漫性轴索损伤发生时,神经元内整合素的表达未发生明显变化,但其下游分子FAK表达上调,从而介导了弥漫性轴索损伤后细胞骨架的破坏。2.弥漫性轴索损伤发生时,神经元TRPC被激活,并通过Ca2+/CaMKⅡ介导了弥漫性轴索损伤后细胞骨架的破坏以及神经元的凋亡过程。