目的:观察白桦脂酸（betulinic acid,BA）对银屑病样小鼠的治疗作用、免疫调节机制以及对角质形成细胞增殖的影响,为治疗银屑病寻找新的低成本药物,也为进一步明确银屑病发病机制提供新的思路。方法:1.白桦脂酸对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠的治疗作用1.1 BALB/c雄性小鼠,随机分组:正常对照组（Control）、模型组（IMQ）,甲氨蝶呤组（MTX）,白桦脂酸低剂量组（BA-L）,白桦脂酸高剂量组（BA-H）。连续7天涂抹咪喹莫特建立银屑病样小鼠模型。1.2每天运用银屑病皮损面积和疾病严重程度（Psoriasis Area and Severity Index,PASI）评价银屑病样小鼠的红斑,鳞屑和皮肤隆起的变化情况。于给药第8天取材。应用H&E染色镜下观察表皮增殖程度。1.3采用免疫组化检测皮损处CD3+T细胞和FoxP3+细胞的浸润程度。2.白桦脂酸对银屑病样小鼠治疗作用的免疫调节机制2.1流式细胞术检测小鼠脾脏和淋巴结内CD8+CD122+Tregs和CD4+Foxp3+Tregs比例,以及淋巴结内CD8+CD122+IL-10+的表达。流式分析术检测小鼠淋巴结内CD4+IL-17A+以及脾脏和淋巴结内γ δ TCR+IL-17A+比例。酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测小鼠血清中IL-10、IL-17、IFN-γ的变化。实时荧光定量PCR法（RT-PCR）检测小鼠皮损处Treg和Th17相关炎性因子mRNA（RORγt、IL-17、IL-6、TNF-α）表达水平。蛋白印迹法（Western Blot）检测小鼠皮损中tmTOR信号通路和NF-κ B信号通路相关蛋白（mTOR、p70S6K、NF-κ B p65）的表达。2.2采用流式细胞分选技术从小鼠分选CD3+T细胞标记CFSE后,在包被anti-CD3/anti-CD28的96孔板加入IL-2刺激培养,同时加入不同浓度的BA,培养4天。流式细胞仪检测BA对T细胞增殖的抑制作用。2.3分别从BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠流式分选出CD8+CD122-细胞,在包被anti-CD3/anti-CD28的96孔板加入IL-15,IL-2刺激因子,同时加入不同浓度的BA,培养5天。流式细胞仪检测BA对CD8+CD122+Tregs的诱导分化作用。2.4 BA诱导CD8+CD122-T细胞分化为CD8+CD122+Tregs。BA诱导的CD8+CD122+Tregs与分选的已标记CFSE的CD3+T细胞,在包被anti-CD3/anti-CD28培养板中,共培养4-5天,Tregs与T细胞按1:4的比例。流式细胞仪检测BA诱导的CD8+CD122+Tregs对T细胞增殖的抑制作用,同时检测共培养上清中的IFN-γ的水平。3.白桦脂酸对角质形成细胞（HaCaT）的细胞周期和细胞凋亡的影响3.1 MTT法检测BA对HaCaTt细胞增殖的影响,采用不同浓度的BA干预对数生长期的HaCat细胞,于48h收集细胞,用MTT法检测细胞的增殖抑制率。3.2流式细胞仪检测白桦脂酸对HaCaT细胞周期的作用,根据MTT法检测结果,选择不同浓度的BA,干预对数生长期的HaCaT细胞,于48h收集细胞,流式细胞仪检测细胞周期。3.3流式细胞仪检测白桦脂酸对HaCaT细胞凋亡的作用,取对数生长期的HaCaT细胞,铺于24孔板,于48h收集细胞流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:1.白桦脂酸对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠的治疗作用第8天的形态学观察显示,正常对照组（Control）小鼠皮肤较薄,无鳞屑,无红斑。模型组（Model）观察到大面积深红色的红斑;覆盖相对较厚鳞屑且鳞屑剥落处可见明显点状出血;皮肤增厚、隆起明显等类似银屑病样皮损改变。BA和MTX治疗组,各组皮损均有不同程度的减轻,表现为红斑颜色相对变浅,鳞屑相对减少,皮肤增厚减轻。MTX组皮肤隆起相对BA组减轻,但其红斑颜色仍偏深红色,且暴露因鳞屑剥落显现的散在点状出血。PASI评分的趋势线显示,在第8天,Model组的PASI评分显著高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.01）;与模型组（Model）相比,BA和MTX治疗组PASI积分均显著降低,差异具有统计学意义（P<0.01）。测量各组小鼠皮损表皮层的垂直厚度,结果显示:与Control组对比,IMQ组表皮厚度增加明显,差异具有统计学意义（P<0.01）;与模型组（Model）相比较,BA和MTX治疗组的皮损表皮厚度均有不同程度减轻,差异均具有统计学意义（P<0.01）,其中BA-H表皮厚度降低最明显。免疫组织化学法检测皮损中CD3+T细胞和FoxP3+细胞,结果显示:与Control组对比,IMQ组皮损中CD3+T细胞浸润显著增加,差异具有统计学意义（P<0.01）。与Model组对比,BA和MTX治疗组的CD3+T浸润降低,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。各组FoxP3+细胞散在分布且较少,与Control组对比,IMQ组皮损中FoxP3+细胞升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与Model组对比,只有MTX组的FoxP3+细胞升高明显,差异具有统计学意义（P<0.01）,BA组FoxP3+细胞升高无显著差异（P>0.05）。2.白桦脂酸对银屑病样小鼠治疗作用的免疫调节机制CD8+CD122+Tregs和CD4+FoxP3+Tregs的流式结果分析显示,淋巴结内,与Control组对比,Model组CD8+CD122+Tregs百分比显著升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。与Model组比较,淋巴结内BA-H组和BA-L组均显著增加了CD8+CD122+Tregs百分比,差异具有统计学意义（P<0.01）;而脾脏中只有BA-H组CD8+CD122+Tregs的百分比提高,差异具有统计学意义（P<0.01）。然而,不论是脾脏还是淋巴结内,MTX组CD8+CD122+Tregs数量无显著提高,差异无统计学意义（P>0.05）。淋巴结内,与Control组对比,Model组CD4+FoxP3+Tregs百分比升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。与Model组比较,淋巴结和脾脏内CD4+FoxP3+Tregs,BA组不论是高剂量还是低剂量的CD4+FoxP3+Tregs的百分比无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）,MTX组CD4+FoxP3+Tregs的百分比明显提高,差异具有统计学意义（P<0.01）。CD4+IL-17A+和γδ TCR+IL-17A+流式结果分析显示,与Control组对比,淋巴结内Model组CD4+IL-17A+频数明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。与Model组相比,不论MTX还是BA均能降低小鼠淋巴结内CD4+IL-17A+频数,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。同时MTX降低CD4+IL-17A+频数趋势更明显。淋巴结内,与Control组对比,Model组γ δ TCR+IL-17A+频数明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）,与Model组相比,MTX和BA均能降低γ δ TCR+IL-17A+频数,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。脾脏内,与Control组对比,Model组 γ δTCR+IL-17A+频数也显著增加,差异具有统计学意义（P<0.01）。与Model组相比,只有MTX和BA-H能降低γ δ TCR+IL-17A+频数,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,而BA-L对γ δ TCRT-IL-17A+频数变化无统计学差异（P>0.05）。淋巴结内CD8+CD122+IL-10+流式结果分析显示,与Control组对比,BA组不论是高剂量还是低剂量均能提高CD8+CD122+IL-10+频数,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,但MTX组CD8+CD122+IL-10+频数未升高,差异无统计学意义（P>0.05）。小鼠血清中的IL-10,IL-17A,IFN-γ的检测结果显示,与Control比较,Model组IL-17A,IFN-γ的含量均高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,而Model组IL-10含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。与Model组相比,不论MTX组还是BA组均能不同程度地降低IL-17A,IFN-γ的水平,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,但MTX组对IL-10的含量变化无统计学差异（P>0.05）,且有低于Model组的趋势。RT-PCR法检测促炎因子mRNA结果显示,与Control 比较,Model组ROR γ t、IL-17、IL-6、TNF-α的mRNA水平均不同程度地显著增加,差异具有统计学意义（P<0.01）。与Model组相比,不论MTX组还是BA组均不同程度地降低ROR γ t、IL-17A、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平,差异具有统计学意义（P<0.05,>P<0.01）。WB检测mTOR信号通路和NF-κ B信号通路相关蛋白表达结果显示,与Control组对比,Model组p70S6K磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白表达量均明显高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.01）。与Model组相比,BA组p70S6K磷酸化蛋白的表达均降低,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;只有BA-H组降低了p70S6K非磷酸化蛋白的表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;而MTX组对p70S6K蛋白（磷酸化和非磷酸化）的表达均无统计学意义（P>0.5）。与Control组对比,Model组p65蛋白（磷酸化和非磷酸化）表达均升高,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Model组相比,不论MTX还是BA均能降低p65磷酸化蛋白表达水平,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,而对于p65非磷酸化蛋白表达,只有MTX组能明显降低其表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。从BALB/c和C57BL/6小鼠脾细胞分选的CD8+CD122-T细胞,BA均能体外诱导其分化为CD8+CD122+Tregs,与Control组对比,IL-15组和BA组均能不同程度诱导CD8+CD122+Tregs,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。BA诱导的CD8+CD122+Tregs与分选的已标记CFSE的CD3+T细胞结果显示,CD8+CD122+Tregs与T细胞按1:4的比例混合培养时能显著抑制T细胞增殖,差异具有统计学意义（P<0.01）。重要的是,该Tregs也显著降低了培养上清中的IFN-γ水平,差异具有统计学意义（P<0.01）。3.白桦脂酸对角质形成细胞（HaCaT）的细胞增殖,细胞周期和细胞凋亡的影响MTT结果显示,BA对HaCaT细胞存在增殖抑制的作用,且具有剂量依赖性。不同浓度BA作用48h后,结果发现,与Control组对比,BA主要阻滞细胞周期于G1期来抑制HaCaT的增殖,差异具有统计学意义（P<0.01）。不同浓度BA作用HaCaT细胞,48h后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果显示,与Control组对比,BA组总凋亡率显著增加,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:白桦脂酸能显著改善咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠的皮损症状和炎症反应。同时抑制表皮增殖,炎性细胞浸润等银屑病样的病理表现。在咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中,BA干预后可诱导CD8+CD122+Tregs而抑制IL-17/Th17的发展。BA也能增加抗炎细胞因子IL-10的产生缓解银屑病样症状。BA还能抑制皮损处促炎细胞因子基因,mTOR信号通路以及NF-κ B信号通路。BA还能在体外诱导CD8+CD122+Tregs,抑制T细胞增殖。同时,BA抑制角质形成细胞的增殖,诱导HaCaT细胞凋亡。因此,BA可成为一种具有前途的自然化合物用于治疗银屑病。