伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV),又叫做奥叶兹基氏病病毒(Aujeszky’s disease virus)、猪疱疹病毒Ⅰ型(Suid herpesvirus 1),属于疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科,是世界上广泛存在的一种病原物。伪狂犬病毒的天然宿主分布广泛,它能够感染除高等灵长类以外的大多数哺乳动物,最主要的天然宿主是猪。伪狂犬病毒能引起母猪的呼吸道炎症、流产、死胎,以及仔猪的死亡,在我国每年都能造成严重的经济损失。伪狂犬病毒基因组长约为150Kb,其中包括长独特区、短独特区、内部重复序列和末端重复序列。伪狂犬病毒基因组能够编码70种蛋白质,分为结构蛋白和非结构蛋白两种。pUL21位于伪狂犬病毒的内层被膜,在疱疹病毒科中诸多病毒都存在且序列保守,应该是维持其毒力的重要基因。UL21基因被认为参与了病毒粒子的包装过程,其缺失株在复制过程中出现大量的未加工的基因组串联体,而且不含基因组的衣壳比例也大大增加。目前有研究表明,修复UL21突变的PRV Bartha株在神经细胞中的逆向轴突感染的速度增加,表明pUL21可能与病毒运输有关。细菌人工染色体(bacteria artificial chromosome,BAC)是基于天然存在于大肠杆菌中的质粒F因子设计的一种能够容纳大片段DNA插入序列的一种载体。BAC一经问世,便被广泛用于构建真核生物基因组文库。BAC文库有稳定性强、插入片段长、复制快、突变容易的优点。BAC用于克隆疱疹病毒基因组始于1997年,其首次应用于小鼠巨细胞病毒[1],自此疱疹病毒的研究翻开了新的篇章。由于通过BAC能够在大肠杆菌中利用原核重组系统对病毒基因组进行突变,省去了构建重组毒时复杂繁琐的过程,也节省了大量的时间,一时间该技术纷纷被用于各种疱疹病毒的基因编辑。本研究出于研究UL21缺失对PRV增殖影响和新建立的BAC平台构建突变株效率的目的,构建了UL21缺失株rPRV-ΔUL21及其回复突变株rPRV-ΔUL21R,并通过空斑大小比较实验研究其生物学特性。在构建rPRV-ΔUL21时先将扩增的Kan表达盒电转化含有pPRV Ea的GS1783,完成第一次Red重组;再分别诱导I-SceⅠ和Red操纵子表达,完成第二次重组。从两次重组的PCR验证来看,重组效率不是很稳定,但每一轮都能挑到阳性克隆,而且并没有受到质粒残留的影响。该结果说明BAC基因编辑平台稳定可靠,能够短时间内构建重组病毒,为病毒基因功能研究节省大量的时间精力。最后western blot验证结果表明,rPRV-ΔUL21完全不表达UL21蛋白,说明PRV的UL21缺失株的构建非常成功。随后进行的空斑大小比较实验结果显示,rPRV-ΔUL21感染MDBK细胞上所产生的空斑大小明显小于PRV Ea株,但是减小的幅度并不大。这说明UL21的确影响PRV病毒在培养细胞上的增殖,但是其功能并不是复制必需的。为了确保UL21基因的突变没有影响与其重叠的lncRNA CTO-L的表达,本研究中采用了real time PCR来检测感染病毒后12h的PK-15细胞中CTO-L的含量。检测结果表明,rPRV-ΔUL21中对UL21的突变不仅基本没有改变CTO-L的序列,同时也没有影响其表达量。本研究在构建重组毒时采用了新构建的细菌人工染色体基因编辑平台,摸索出了一套正确的使用方法,方便后续其它成员构建重组病毒研究基因功能。对UL21缺失病毒生理特性的研究则进一步完善了对UL21基因功能的相关研究,加深了我们对UL21,尤其是对其与CTO-L之间关系的理解。