论文部分内容阅读
多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome MODS)是临床重症患者死亡的主要原因之一。其发病机制尚未明确,最新研究认为全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)使得自体修复功能障碍,并进一步造成微血管损伤、微循环障碍,从而引起MODS,同时这可能就是MODS的始发环节。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cell, EPC)是成熟血管内皮细胞的前体细胞,属于干细胞群体,既可不断增殖又能定向分化为成熟的内皮细胞。EPC不仅参与人胚胎血管生成,同时也参与出生后血管新生和血管内皮损伤后的修复过程,是目前研究损伤血管修复的热点之一。大量的动物和临床实验都已经证明：当组织受到一定程度的损伤时,循环及组织中EPC可以在组织内分化为内皮细胞替换功能障碍的内皮细胞、修补裸露的血管内皮损伤区,并参与缺血或损伤组织内新血管生成,从而改善缺血器官的功能；然而,当机体受到过度的损伤刺激时,EPC的分化、迁徙功能也会发生严重障碍,则会导致损伤部位微循环严重损害而无法得到修复,从而发生器官功能障碍。研究显示,VEGF基因修饰的EPC移植治疗创伤后缺血性疾病,将可能最大程度的发挥两者促血管再生作用,移植VEGF基因修饰的EPC可以显著降低MODS的发生率,并改善MODS的预后。为此,本文从EPC对自体修复的角度出发,探讨携带VEGF-绿荧光蛋白(Green Fluorescent Portein, GFP)双表达基因慢病毒转染EPC后的细胞特性及移植慢病毒介导hVEGF165-GFP基因转染的内皮祖细胞预防和治疗MODS的理论依据。本研究共分为四部分,首先通过内毒素+失血性休克制造出MODS的家兔动物模型,同时在体外建立起EPC培养和鉴定体系,由慢病毒(LV)转染VEGF-GFP双表达基因的EPC,将体外培养增殖转染EPC移植入MODS的动物,观察移植后MODS的发生率和重要脏器的微血管密度改变情况,评价移植转染VEGF-GFP双表达基因的EPC防治MODS的效果,并对其作用机制进行初步探讨。第一部分多器官功能障碍动物模型的建立在本研究的第一部分我们首先成功地复制了双相迟发型的家兔MODS模型,为创伤后多器官功能障碍的相关研究提供了实验基础。将体重2.52±0.27Kg健康雄性家兔随机分为2组：实验组(MODS)12只,施行失血性休克+内毒素血症复合因素；对照组(C)12只,施行假手术,予以颈动静脉置管,不实施失血及内毒素注射。监测各重要器官功能变化,并行主要器官病理形态学检查(大体、光镜)。结果显示各重要器官功能下降或衰竭。病理学改变主要表现为炎症为主的非特异性改变。实验组MODS发生率为83.3%,死亡率为75.0%,显著高于对照组。本实验采用二次打击,与临床实际相符,且MODS的发生率及死亡率均高,操作简单,容易复制,是一个较成功的动物模型。第二部分携带VEGF-GFP双表达基因慢病毒载体的建立及体外转染内皮祖细胞本部分通过建立可稳定携带VEGF+GFP的双表达基因的慢病毒载体,并转染体外培养的内皮祖细胞,为下一步的回输治疗提供充足的细胞源。hVEGF165的PCR引物并扩增,经酶切、连接转化至含GFP的慢病毒表达载体：pWPXL-MOD后挑取阳性克隆,利用限制性内切酶BamH I、Mlu I双酶切后经电泳鉴定并测序。含VDGF-GFP的表达载体pWPXL-MOD与慢病毒包装质粒:pRsv-REV, pMDlg-pRRE,及包膜质粒pMD2G共同组成四质粒系统,通过磷酸钙法共转染293T细胞后获得慢病毒颗粒,经浓缩后可获得高滴度的LV-VEGF-GFP.在MOI值=50的条件下与EPC共培养以感染EPC。对LV/hVEGF165-GFP-EPC进行增殖功能进行检测。结果表明,目的基因插入慢病毒过表达载体pWPXL-MOD后经PCR扩增,证实载体片段与目的片段均可表达,并且基因测序报告显示：重组质粒中的插入片段序列与目的基因VEGF的CDS序列一致,成功构建并包装了慢病毒载体,并证实EPC经LV/hVEGF165-GFP转染后其增殖功能较未转染EPC提高。第三部分慢病毒介导hVEGF165-GFP基因转染内皮祖细胞移植治疗MODS后器官微血管密度变化及意义本部分旨在探讨移植慢病毒介导hVEGF165-GFP基因转染的内皮祖细胞对家兔创伤后多器官功能障碍治疗的有效性和安全性的研究,同时比较单纯移植EPC治疗MODS的疗效差异。构建动物模型,将达到MODS的动物随机分为三组,单纯EPC移植组(ET)12只和转染内皮祖细胞移植组(VT)12只,在固定时间点,分别以1×107个细胞／Kg(体重)的剂量进行移植治疗。同时以未行任何干预的MODS(M组,12只)作为对照组。结果显示：慢病毒介导hVEGF165-GFP基因转染内皮祖细胞移植组(VT)的MODS发生率和动物死亡率均低于单纯移植EPC组(ET)和对照组,各重要器官的免疫组化检测显示微血管密度明显高于单纯移植EPC组(ET)和对照组,提示移植VEGF修饰的内皮祖细胞可以有效的促进创伤后的修复,防止MODS的发生和发展,同时可改善MODS动物的预后以及延长生存时间。