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褪黑素又名N-乙酰基5-甲氧色胺,是主要由松果体合成并分泌的一种吲哚类神经内分泌激素。除松果体外,其它组织和器官也可以合成,如纹状体、视网膜、脾、肝和胃肠道等。褪黑素作为一种脂溶性小分子物质,其发挥作用的方式是多渠道的,既可以结合存在于细胞膜表面的膜受体,向细胞内释放第二信号分子发挥作用,也可以直接进入细胞膜,与细胞核内的受体结合发挥作用,作用方式复杂。褪黑素具有多种多样的生理学作用,如:调节日夜节律,抑制生殖系统发育成熟,调节骨骼生长,抑制肿瘤发生,调节免疫,清除自由基抗氧化等。褪黑素具有抗癌的作用,通过促进肿瘤细胞凋亡,抑制增殖,调节抗肿瘤免疫,清除自由基,竞争性抑制雌激素等,但是褪黑素作用的细胞内信号通路尚不十分明确。褪黑素抗胃癌的相关研究比较少,为了进一步明确褪黑素对胃癌细胞的作用及其分子机制,本研究选取3种人胃癌细胞系AGS、SGC-7901及MGC803,采用蛋白质组及磷酸化芯片筛选褪黑素作用位点,构建褪黑素受体敲除细胞株,分析褪黑素作用后对胃癌细胞增殖及免疫方面的影响,并通过检测与增殖相关的蛋白变化及细胞因子变化以阐明其抗胃癌的分子机制。本研究第一部分主要通过高通量筛选的方法,采用蛋白质组和磷酸化芯片分析褪黑素作用胃癌细胞后蛋白质表达及磷酸化水平的差异,来分析褪黑素的可能作用位点。褪黑素作用后将差异蛋白质质谱分析结果分类,可以归为三组。第一组为细胞代谢相关酶类。如:乳酸脱氢酶B、异柠檬酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶等。第二组为细胞氧化还原酶类,如:谷胱甘肽S-转移酶、抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6、超氧化物歧化酶等。第三组为分子伴侣与细胞骨架等结构蛋白。如:HSP70蛋白1、分子伴侣蛋白TCP1复合物、角蛋白8、蛋白酶体α6亚单位等。在磷酸化芯片中,差异磷酸化蛋白分析筛选出褪黑素作用后50个蛋白磷酸化水平上调以及15个蛋白磷酸化水平下调,DAVID在线数据库信号通路富集分析提示数条信号通路参与到褪黑素对胃癌细胞的作用中,如:MDM2/p53、Jak1/STAT3、MEK/cJun等,为褪黑素抗胃癌作用机制的研究提供了方向。本研究第二部分重点探讨褪黑素对胃癌细胞增殖的影响。本部分研究明确了褪黑素作用引起人胃癌细胞增殖抑制,细胞周期阻滞在G1/S期,此作用是通过抑制胃癌细胞内AKT/MDM2/CDC25A途径引起。随后采用CRISPR/Cas9基因编辑的方法敲除褪黑素的膜及核受体,分析不同受体在褪黑素抑制胃癌细胞增殖中的作用。构建了敲除膜MTNR1A及MTNR1B受体的AGS-KOM细胞株,敲除RORα核受体的AGS-KOA细胞株,敲除RORβ核受体的AGS-KOB细胞株和敲除RORγ核受体AGS-KOC细胞株。通过ECIS活细胞动态分析仪分析褪黑素作用后不同受体缺陷细胞株的增殖行为,发现胃癌细胞对褪黑素的快速反应以膜受体及RORα核受体为主。本研究第三部分主要研究褪黑素抑制胃癌细胞的免疫相关机制,探讨褪黑素对胃癌细胞分泌细胞因子的影响。分析褪黑素作用后是否通过调节免疫相关细胞因子的表达,改变胃癌局部免疫抑制微环境。本实验通过比较褪黑素作用前后人胃癌细胞培养上清中VEGF、TGF-β1、IL-10及IFN-γ四种细胞因子的变化,分析其对抗胃癌免疫的影响及机制。在褪黑素作用3种胃癌细胞中,VEGF和IFN-γ变化较为一致,VEGF下调,IFN-γ上调。VEGF的分泌下调既可以起到抑制局部肿瘤血管生成的作用,也可以改变肿瘤微环境起到抑制MDSC的作用。IFN-γ上调有利于提高抗肿瘤免疫的产生。而TGF-β1、IL-10变化3种细胞有差异:TGF-β1在MGC803和SGC-7901中下调,AGS上调;IL-10在AGS和SGC-7901中下调,MGC803上调。这说明不同的胃癌细胞在这两个因子的表达上有差异,其对抗肿瘤免疫的影响还要结合褪黑素对免疫细胞的作用及其在体内的具体情况来分析。总之,本研究采用蛋白质组和磷酸化芯片筛选了褪黑素作用后胃癌细胞蛋白表达及磷酸化差异位点,证实褪黑素作用后引起胃癌细胞周期阻滞在G1/S期,通过AKT/MDM2/CDC25A途径引起胃癌细胞增殖抑制,建立了褪黑素受体缺陷胃癌细胞模型,活细胞动态分析表明胃癌细胞对褪黑素的快速反应以膜受体及RORα核受体为主,探讨了褪黑素对胃癌细胞分泌免疫相关细胞因子VEGF、TGF-β1、IL-10及IFN-γ的作用,为进一步研究褪黑素抗胃癌及抗胃癌免疫方面的分子机制提供了基础。