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通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,从瑞氏木霉(Trichoderma reesei)天然纤维素水解酶中分离纯化到外切葡萄糖苷酶CBH Ⅰ(cellobiohydrolase Ⅰ),以该酶为研究对象,初步探讨了对不同底物的活性。以蔗糖和对硝基酚纤维二糖(pNPC)为底物,检测出该酶的水解活性。45℃,pH5.5时,CBH Ⅰ对蔗糖的水解酶米氏常数Km=5.29mg/ml,Vmax=0.420ug/min;对pNPC的水解酶米氏常数Km=2.95mg/ml,Vmax=0.041 ug/min。在长时间内,用DNS法和对硝基酚法分别检测了蔗糖反应体系还原糖生成量变化和pNPC反应体系对硝基酚生成量变化。结果表明在两个反应体系中都有明显的可逆反应存在,水解产物生成量出现周期性振荡特征。还原糖生成量振荡周期为21.67±2.89分钟;对硝基酚生成量振荡周期为23.75±2.5分钟。
用DNS法分别检测了长时间内CBH Ⅰ与木糖、果糖反应的体系中还原糖含量变化。结果显示,在封闭的反应体系中有明显的可逆反应存在,还原糖含量出现周期性振荡特征。还原糖含量振荡周期分别为33.33±5.77分钟和41.75±9.07分钟。
同时,为了证实该酶是否有糖苷合成活性,对木糖与CBH Ⅰ反应5分钟后的产物做乙酰化处理,进行GC/MS分析。试验结果证实了产物中有二糖结构类型成分,说明了CBH Ⅰ对木糖有糖苷合成活性。