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随着工业生产的发展,生殖障碍的发病率逐年升高,不仅对畜牧业造成经济损失,而且对人类健康构成严重威胁。通过构建雄性动物生育缺陷的模型,探讨生育缺陷的发生机制,是当前生殖领域研究的焦点。近年来,许多在动物生殖过程中发挥重要作用的调控因子相继被发现。在发生受精时,精子中的特异性磷脂酶C zeta（PLCζ）会通过融合孔进入卵母细胞胞质中,启动卵母细胞内Ca2+振荡,从而激活卵母细胞。研究发现,雄鼠Plcz1基因表达缺陷会导致生育能力下降,并且影响后代早期胚胎发育,使囊胚率下降,但关于PLCζ)在精子发生和后代早期胚胎发育中的作用及调控机制尚未完全阐明,且在研究中缺乏有效的生殖障碍动物模型。本研究利用CRISPR-Cas9系统构建Plcz1基因敲除（Plcz1-/-）小鼠模型,通过统计后代数量、分析精子活力、观察组织病变等方法对Plcz1-/-小鼠的生殖能力进行评价,并通过采用RNA测序的方法对Plcz1基因缺失影响小鼠生殖能力的机制进行初步探究。（1）为构建Plcz1基因敲除小鼠模型,本研究选择小鼠Plcz1基因第6、7外显子（exon）作为靶位点,前后两个位点设计2对sgRNA,并采用Golden Gate方法将其插入pX330质粒,构建pX330-sgRNA重组质粒。通过采用显微注射方法将质粒导入小鼠受精卵中,进行胚胎移植。分娩后,提取仔鼠尾DNA,采用DNA测序方法对目的基因片段的序列进行分析;采用Western blot方法检测PLCζ蛋白表达。结果显示,成功构建pX330-sgRNA重组质粒;通过繁育和测序鉴定获得3只Plcz1-/-小鼠:Plcz1m3（exon 6、7 共缺失 3078 bp）、Plcz1m4（exon 7 缺失 7 bp,该小鼠在饲养过程中死亡）、Plcz1m5（exon 6缺失1 bp）;Western blot结果显示Plcz1m3小鼠PLCζ蛋白缺失。（2）为探讨Plcz1基因敲除对雄鼠生育能力的影响,本研究将性成熟后的Plcz1m3和Plcz1m5分别与野生型（wild-type,WT）小鼠进行交配,得到F1代Plcz1-/-小鼠,经自交后得到F2代小鼠,鉴定Plcz1-/-雄鼠,并评价其生育能力;采用胚胎体外培养的方法,分析Plcz1-/-雄鼠胚胎发育率;收集受精后的卵母细胞,采用免疫荧光的方法观察多精入卵的现象;制备精子悬液,用计算机辅助精子分析（CASA）自动检测系统测定精子活力和运动学参数;测定生殖器官的生长指标;采用HE染色方法观察雄鼠生殖器官的病理组织变化。结果显示,与WT小鼠相比,Plc1m3和Plcz1m5小鼠生育能力显著性下降（P＜0.05）;Plcz1m3和Plcz1m5小鼠囊胚率均呈显著性下降（P＜0.05）,同时其异常受精卵比率呈显著性升高（P＜0.05）;Plcz1m3和Plcz1m5小鼠呈现多精入卵及异常激活卵母细胞的现象;Plcz1m3小鼠的精子活力和运动学参数均有显著性下降,而Plcz1m5小鼠无显著性变化;Plcz1m3小鼠的睾丸和附睾相对重量呈显著性下降,而Plcz1m5小鼠睾丸相对重量呈显著性上升;附睾和睾丸组织切片的观察结果显示Plcz1m3小鼠精子发生障碍,而Plcz1m5小鼠无明显变化。（3）为探究Plcz1基因敲除对精子发生的影响机制,本研究采用RNA-Seq方法对Plcz1m3小鼠附睾组织的RNA进行测序分析;采用qPCR方法验证相关基因的表达;采用免疫荧光的方法观察骨架蛋白在早期胚胎中的分布。结果显示,与WT小鼠相比,Plcz1m3和Plcz1m5小鼠附睾中Tubα3a表达水平显著性降低（P＜0.05）;Plcz1m3和Plcz1m5小鼠在精子的生成和调节方面均有影响;Plcz1m3和Plcz1m5小鼠胚胎的α-Tubulin荧光分布不均匀,Plcz1m5小鼠胚胎中α-Tubulin的荧光分布有边缘化表现。综上表明,本研究成功构建Plcz1基因敲除小鼠模型:Plcz1m3和Plcz1m5,二者的生殖能力均出现明显下降;Plcz1m3小鼠生殖能力下降与精子发生障碍有关,Plcz1m5小鼠生殖能力下降仅与受精时多精入卵有关;Plcz1m3小鼠精子发生障碍与附睾中细胞骨架蛋白功能缺陷有密切联系。本研究可为进一步揭示生殖障碍疾病的发病机制提供理论依据和有效的研究工具。