论文部分内容阅读
还原力NADH是微生物产生1,3-丙二醇途径必需的物质。微生物在生成1,3-丙二醇的途径中伴随着很多副产物,如乙醇、乳酸、琥珀酸、2,3-丁二醇(2,3-BD)等,这些副产物的生成与1,3-丙二醇产生途径竞争NADH。本工作一方而在野生型K. oxytocaM5al中引入NADH再生系统,另一方面将K. oxytoca M5al中产生乙醇的途径阻断掉,以使更多的NADH流向1,3-丙二醇产生途径。
在M5al中构建了NADH再生系统(pDK7-fdh),为了重组质粒pDK7-fdh能够在细胞繁殖过程中稳定遗传,在重组质粒pDK7-fdh中引入了质粒平均分配基因parDE得到重组菌株F6。F6在传代160代后质粒仅丢失3％,甲酸脱氢酶(FDH)酶活与传代前相比只降低了1.77％；而不含parDE的重组菌FY和F-1传代160代后质粒分别丢失了78％和93％,FDH比酶活分别降低了25％和49％。上罐检测甲酸脱氢酶酶活表明F6最高比酶活为26.32 U/mg,是M5al最高比酶活10.79U/mg的2.43倍。
F6摇瓶实验表明,加入甲酸脱氢酶的底物甲酸钠后,1,3-丙二醇的生产强度明显加强,发酵47 h达到0.3 g·l-1h-1,而没有加入甲酸钠的F6只有0.19 g·l-1h-1;且添加甲酸钠后副产物乙酸提高了7.2倍,乙醇产量提高了1.2倍。另外,F6和M5al发酵58 h的1,3-丙二醇产量并没有明显提高,分别是13.75g/l和13.16g/l,但是乙醇和乙酸的产量分别提高了24％和30％,且F6的生长加快。
另外,利用自杀载体pGPCm和pGPKm成功构建了aldH缺失突变株(MH)和adhE缺失突变株(ME)。比酶活测定结果显示,MH的ADH与M5al相差不大,分别为11.44U/mg和11.86 U/mg,而ALDH比酶活为0.796 U/mg,是M5al的22％；ME的ADH比酶活只有4.74 U/mg,是M5al的40％,ALDH比酶活是0.934 U/mg,为M5al的26％。在有氧和厌氧条件下,ME都几乎没有乙醇产生,而M5al乙醇最高产量分别为3.29 g/l和1.1 g/l。摇瓶发酵表明,在阻断了菌体的乙醇生成途径后,ME的生长速率明显降低,由此造成甘油消耗率降低,1,3-丙二醇的生成速率也随之降低。但是另一种化工和食品中十分有用的产物--2,3-丁二醇的生成却明显升高,发酵48 h 2,3-丁二醇的产量是10.23 g/l,比M5al提高了51％；延长发酵时间至72 h后1,3-丙二醇的产量最高为15.89g/l,2,3-丁二醇最高产量却达到了13.81g/l,M5al 1,3-丙二醇最高是17.38g/l,2,3-丁二醇只有6.58g/l,即ME 2,3-丁二醇的产量比对照提高了约1.1倍。与M5al相比,MH的乙醇产量并没有明显降低,1,3-丙二醇产量也无明显变化,而乙酸的产量却升高了。