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乳对新生哺乳动物的发育至关重要,在能消化固体食物之前是唯一的理想食物。它不仅可以提供营养,而且可以提供免疫防御因子。牛乳又是食用乳制品的最主要原料,因而提高牛乳产量改善牛乳品质成为泌乳生物学研究的重点目标之一。乳腺泌乳的过程受到神经和激素的双重调节,随着泌乳生物学研究的发展,泌乳功能相关基因及其信号通路及表观遗传调控机制对乳腺发育泌乳的作用越来越受到研究者的关注。DNA甲基化作为表观遗传调控机制之一,以其可调控可遗传的特性而被应用于农牧业的遗传育种试验中。近些年研究发现DNA甲基化水平与奶牛的乳品质调控相关,但其作用机制仍在探索中。本研究首先应用原代培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)确立DNA去甲基化状态奶牛乳腺细胞上皮模型与DNA甲基化状态奶牛乳腺上皮细胞模型目的在于探究DNA甲基化水平对奶牛乳腺上皮细胞功能的作用及其机制。实验应用甲基转移酶抑制剂5-Aza确立去甲基化奶牛乳腺细胞模型,而后应用细胞活力测试与甲基化敏感限制酶切法检测去甲基化试剂5-Aza对奶牛乳腺上皮细胞DNA甲基化水平的影响;结果显示5-Aza能降低BMECs基因组DNA甲基化水平,而后应用过表达甲基转移酶3α(DNMT3A)载体转染奶牛乳腺上皮细胞确立DNA甲基化奶牛乳腺上皮细胞模型,应用荧光定量检测技术分析转染DNMT3A过表达质粒后,奶牛乳腺上皮细胞中DNMT3A在mRNA水平的表达显著增加。继而应用双荧光素酶报告基因系统筛选出AKT1基因启动子区域,并用重亚硫酸盐测序法分别分析不同细胞模型中AKT1启动子区上游CpG位点甲基化的特异性。结果表明,与空白对照组相比确立的DNA去甲基化奶牛乳腺细胞模型中,DNA启动子区甲基化水平显著降低;DNA甲基化奶牛乳腺上皮细胞模型中,DNA启动子区甲基化水平明显升高。进一步验证DNA甲基化状态/去甲基化状态的细胞模型确立成功。应用qRT-PCR技术分别检测DNA去甲基化细胞模型、DNA甲基化细胞模型与空白对照组细胞的与泌乳功能相关基因AKT1、RPS6KB1、STAT5A、mTOR、CyclinD1在mRNA水平的表达变化;通过Western blot技术分别检测去DNA甲基化细胞模型、DNA甲基化细胞模型与空白对照组细胞中上述基因蛋白及其磷酸化蛋白的表达变化。结果显示与空白对照组相比DNA去甲基化细胞模型中与乳腺发育增殖相关的AKT1、CyclinD1及其磷酸化蛋白的表达显著升高,与产乳品质相关的RPS6KB1、STAT5A、mTOR及其磷酸化蛋白的表达均显著升高,而DNA甲基化细胞模型中这些蛋白及其磷酸化蛋白的表达则受到明显抑制。应用Western blot技术分析DNA甲基化水平对BMECs合成β酪蛋白的影响;结果显示,在BMECs中DNA甲基化水平与β酪蛋白的表达呈明显的负相关效应。应用乳糖、乳脂检测试剂盒检测甲基化水平对BMECs合成乳糖与乳脂的影响;结果表明,在BMECs中DNA甲基化水平越高乳糖乳脂合成越低。以上实验结果显示DNA甲基化水平的高低影响奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的变化,DNA甲基化可能通过参与调节泌乳功能相关基因的表达继而影响奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能。