心血管系统疾病一直以来严重危害着人类的生命健康,由于冠状动脉病变和脑血管意外在人群中具有较高的发病率和病死率,使得这两种疾病已经得到充分的重视,但人们对病死率紧随这两者之后的急性肺动脉栓塞(Acute Pulmonary Embolism,APE)的认识和关注却相对比较缺乏。肺栓塞由血栓、脂肪、羊水、空气等各种栓子阻塞肺动脉系统后导致,其中以血栓栓塞最为常见,血栓来源于静脉系统和右心,以下肢深静脉来源最多见。栓子阻塞肺动脉及其分支后引起循环和呼吸功能障碍,急性肺血栓栓塞造成肺动脉较广泛阻塞时,可引起肺高压,严重时导致右心失代偿、右心扩大,继而出现急性肺源性心衰,最终可导致死亡。目前诊断该病的金标准为肺血管造影(Pulmonary Angiography,PA),该检查属于有创检查,有发生致命性或严重并发症的可能。计算机断层摄影肺动脉造影术(Computed Tomographic Pulmonary Angiography,CTPA)是当前最常用的APE确诊手段,但对于肾功能不全和造影剂过敏的患者,该检查的应用受到限制。循环血中对APE诊断有一定参考意义的是血浆D-二聚体,但该指标敏感性高特异性差,主要用于APE的排除诊断以及患者的危险分层。总之APE的诊断尚缺乏一种诊断效益高、无创的、广泛适用、可快速获取结果的方法。如果能在循环血中寻找到兼备高敏感性和特异性的APE诊断标志物,将为APE的早期快速诊断带来希望。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一种小分子的非编码RNA,它在转录后水平对基因表达发挥调控作用。研究证实mi RNA的表达具有组织和细胞特异性,在特殊情况下可以释放入血,脱离细胞的mi RNA通过与蛋白类物质或微泡等结构相结合的形式逃避血液中RNA酶的降解从而稳定地存在。这些特征使人们将循环血中mi RNAs水平的改变与某些疾病联系起来,mi RNAs既可能在疾病发生发展的过程中起到了调控作用,也可能直接由受损的病变组织释放入血。基于以上考虑,研究者们开始探索循环血mi RNAs针对不同的疾病是否具有一定的诊断价值,目前相关的研究已经从肿瘤快速扩展到多个疾病领域。在心血管领域研究较多的是循环血mi RNAs与心肌梗死、心衰等的关系,既往研究提示mi RNAs在心肌梗死的诊断中极具潜力。本实验的目的在于初步探索循环血中mi RNAs是否具备成为诊断APE的生物标志物的潜质。一、急性肺动脉栓塞动物模型的建立研究目的:制备急性肺动脉栓塞大鼠模型。实验方法:(一)将SD大鼠随机分为6小组,分别为:正常组、APE后1h组、3h组、6h组、12h组、24h组,每组n=10。采用经颈静脉自体血栓注入法制备APE动物模型。(二)采集各组大鼠的血液样本和肺组织样本。(三)通过两种方法验证模型,分别是观察APE模型组建模前后一般情况的改变和对比APE模型组与正常组的肺组织HE染色切片。实验结果:APE建模的麻醉成功率为96.55%(56/58),栓塞成功率为89.29%(50/56)。建模后大鼠出现气急、心率加快、口唇和皮肤紫绀等表现,苏醒后与造模前相比活动减少,纳差,反应迟钝。正常组HE染色切片表现正常,APE组HE染色切片上可见血栓填塞肺动脉血管腔,肺组织不同程度的水肿和炎症细胞浸润,部分肺泡间隔增宽,肺泡壁连续性破坏,偶可见出血点。结论:通过选择合适的实验动物和造模方法,以及把握造模过程中的细节可以成功建立急性肺动脉栓塞动物模型。二、候选循环血mi RNAs在急性肺动脉栓塞动物模型中表达量的检测研究目的:检测候选循环血mi RNAs在APE动物模型中的表达情况,寻找对APE有诊断价值的循环血mi RNAs。实验方法:(一)通过查阅文献报道结合本实验室前期的研究工作筛选循环血候选mi RNAs作为本实验的检测目标,确定合适的循环血mi RNAs内参,标化实验结果。(二)选择基于SYBR Green荧光染料的实时定量PCR反应法,检测候选mi RNAs在APE动物模型中的表达情况及其随时间动态变化的趋势。(三)采用ELISA法检测动物模型血浆中D-二聚体水平及其随时间的动态变化趋势。(四)绘制接受者工作曲线(ROC curve)评价循环血mi R-195、mi R-486、D-二聚体以及mi R-195联合D-二聚体对APE动物模型的诊断价值。实验结果:(一)我们确定了以下13个循环血mi RNAs作为本实验的候选mi RNAs:mi R-134、mi R-410、mi R-195、mi R-200c、mi R-486、mi R-146b、mi R-34b、mi R-192、mi R-363、mi R-328、mi R-26、mi R-101、let-7α。选择mi R-16作为循环血mi RNAs定量PCR的内参。(二)mi R-134、mi R-410、mi R-200c、mi R-34b、mi R-363、mi R-101信号值过低难以测出;mi R-195、mi R-192的表达量在APE发生后呈上升的趋势,其中mi R-195的变化具有统计学意义(P<0.01);mi R-486、let-7α的表达量在APE发生后有下降的趋势;mi R-328、mi R-26、mi R-146的表达量在APE发生后未见明显变化;进一步检测目标mi RNAs随时间的变化趋势,mi R-195在APE发生1h后表达量即显著升高(P<0.05),在APE发生6~12h时上升至最高,24h后开始下降;mi R-486在APE发生6h后表达量显著下降(P<0.05),APE发生12h时降到最低,24h时仍然保持在低水平;其余各mi RNAs在APE发生后表达量随时间的变化不具有统计学意义。(三)D-二聚体的含量在APE发生后3h时显著升高(P<0.05),之后逐渐降低。(四)mi R-195绘制的ROC曲线下面积为0.956(P<0.01),mi R-486绘制的ROC曲线面积下为0.740(P>0.05),血浆D-二聚体绘制的ROC曲线下面积为0.861(P<0.05)。当mi R-195相对表达量为1.706时,其对APE动物模型诊断的特异性为100%,敏感性为80%。mi R-195联合D-二聚体(APE 6h组)绘制的ROC曲线下面积为0.964(P<0.01),当诊断特异性为100%时,灵敏度为85.7%。mi R-195联合D-二聚体(APE 3h组)绘制的ROC曲线下面积为0.813(P<0.05),当诊断特异性为100%时,灵敏度为62.5%。结论:(一)循环血mi R-195在急性肺动脉栓塞模型中表达量升高,并且在建模早期即有明显升高,其含量随时间呈动态变化趋势。(二)循环血mi R-195对APE动物模型的诊断价值较高,当联合D-二聚体的时候诊断效能进一步提高,可能为临床上开辟高效的APE诊断方法提供新的思路。