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SIRT1是一种NAD+依赖性去乙酰化酶，利用去乙酰化酶活性在多种生理过程中发挥调节作用，包括基因转录、糖脂代谢、应激反应等。肾脏受到缺血缺氧、代谢异常等因素的刺激时，SIRT1的表达及活性被抑制，其目标蛋白异常转录与活化，引起肾组织氧化损伤、细胞凋亡和纤维化。研究显示，SIRT1基因缺陷能够加重糖尿病、缺血再灌注及单侧输尿管梗阻等引起的肾损伤。然而，SIRT1在肾损伤中的作用及其具体分子机制如何还未可知。SRT1720是一种小分子化合物，能够诱导SIRT1的表达和活化。本研究将以SRT1720为工具，采用体内外实验，探究SIRT1在糖尿病及缺血再灌注诱导的肾损伤中的作用及其分子机制。
第一部分SRT1720对糖尿病肾小管细胞凋亡的作用
目的探讨SRT1720对糖尿病诱导的肾小管细胞凋亡的影响及机制。
方法以10周龄雄性db/db小鼠和同窝对照db/m小鼠为研究对象，随机分为三组：db/m组，db/db组，SRT1720治疗组(给予db/db小鼠50mg/kg/day的SRT1720灌胃治疗)。10周后取材，检测各组小鼠肾功能，PAS染色观察肾组织损伤情况，TUNEL染色检测肾细胞凋亡，免疫组织化学检测肾组织中SIRT1、Bax、Bcl-2、cleavedcaspase3、8-OHdG、NOX4、HO-1、p-p66Shc、Ac-HistoneH3的表达和定位，westernblot检测肾组织中SIRT1、Bax、Bcl-2、cleavedcaspase3、NOX4、HO-1、SOD2、p-p66Shc、p66Shc、Ac-HistoneH3、HistoneH3的表达水平。体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2)，随机分为七组：正常对照组，高糖组，高糖加SRT1720(2.5μM)干预组，高糖加siRNA转染对照组，高糖加p66ShcsiRNA转染组，高糖加NAC干预组，高糖加Tempol干预组。连续培养48h后，TUNEL染色检测细胞凋亡率，MitoSOXRed探针检测线粒体ROS水平，免疫荧光检测SIRT1表达，免疫细胞化学检测p-p66Shc、Ac-HistoneH3表达，westernblot检测SIRT1、p66Shc、p-p66Shc、Ac-HistoneH3、HistoneH3、Bax、Bcl-2、cleavedcaspase3、NOX4、HO-1、SOD2的表达。
结果与db/m组相比，db/db组小鼠肾组织中SIRT1的表达和活性降低，空腹血糖、肌酐、尿素氮及24h尿白蛋白明显增加；与db/db组相比，SRT1720治疗组小鼠肾组织中SIRT1的表达和活性增加，血糖、肌酐、尿素氮、24h尿白蛋白降低，差异具有统计学意义。与db/db组相比，SRT1720治疗组肾细胞凋亡明显减少，Bax、Bcl-2、cleavedcaspase3、8-OHdG、NOX4、HO-1的表达降低，SOD2表达增加；此外，与db/m组相比，db/db组小鼠肾组织中p66Shc、p-p66Shc、Ac-HistoneH3的表达明显增加，SRT1720治疗组p66Shc、p-p66Shc、Ac-HistoneH3的表达较db/db组下降，差异具有统计学意义。体外实验中，与对照组HK-2细胞相比，高糖组SIRT1表达和活性均降低，SRT1720刺激组SIRT1的表达和活性高于高糖组；与高糖组相比，SRT1720刺激组细胞凋亡率下降，线粒体ROS产生减少，Bax/Bcl-2的比率和cleavedcaspase3的表达下降，NOX4、HO-1的表达减少，SOD2的表达增加，p66Shc、p-p66Shc、Ac-HistoneH3表达被抑制；机制研究结果显示，与高糖组相比，抗氧化剂NAC干预组、Tempol干预组、p66ShcsiRNA转染组的细胞凋亡率及线粒体ROS的产生下降，Bax/Bcl-2的比率和cleavedcaspase3、NOX4、HO-1的表达降低，SOD2的表达增加。
小结SRT1720抑制糖尿病或高糖诱导的肾小管细胞凋亡，这可能是通过抑制p66Shc介导的氧化应激实现的。
第二部分SRT1720对糖尿病肾纤维化的作用
目的探究SRT1720对糖尿病诱导的肾纤维化的影响及作用机制。
方法以10周龄雄性db/db小鼠和同窝对照db/m小鼠为研究对象，随机分为三组：db/m组，db/db组，SRT1720治疗组(50mg/kg/daySRT1720灌胃干预db/db小鼠)。10周后取材，Masson染色观察肾组织中的胶原沉积，免疫荧光检测Fibronectin，CollagenIV和GLUT1的表达，免疫组织化学检测E-cadherin、α-SMA、TGF-β1、CTGF、NF-κBp65、HIF1α和SNAIL的表达和定位，westernblot检测E-cadherin、α-SMA、TGF-β1、CTGF、NF-κBp65、HIF1α、GLUT1和SNAIL的表达水平。体外培养HK-2细胞，随机分为六组：正常对照组，高糖组，高糖加SRT1720(2.5μM)干预组，高糖加siRNA转染对照组，高糖加Hif1αsiRNA转染组，高糖加Glut1siRNA转染组。持续培养48h后，免疫荧光检测Fibronectin、CollagenIV、E-cadherin、α-SMA、HIF1α、GLUT1的表达，免疫细胞化学检测SNAIL的表达，westernblot检测Fibronectin、CollagenIV、E-cadherin、α-SMA、HIF1α、GLUT1和SNAIL的表达水平。
结果与db/m组相比，db/db组小鼠肾组织胶原沉积增加，Fibronectin、CollagenIV、α-SMA的表达增加，E-cadherin表达减少，TGF-β1、CTGF、NF-κBp65的表达增加；与db/db组相比，SRT1720干预组肾组织胶原沉积减少，Fibronectin、CollagenIV、α-SMA的表达下降，E-cadherin表达增加，同时，TGF-β1、CTGF、NF-κBp65的表达降低。此外，与db/m组相比，db/db组小鼠肾组织中HIF1α、GLUT1和SNAIL的表达增加；与db/db组相比，SRT1720干预组上述蛋白的表达下降。体外实验中，与对照组HK-2细胞相比，高糖组Fibronectin、CollagenIV、α-SMA的表达增加，E-cadherin表达下降；与高糖组相比，SRT1720干预组Fibronectin、CollagenIV、α-SMA的表达降低，E-cadherin表达增加；此外，与对照组相比，高糖组HIF1α、GLUT1和SNAIL表达明显增加，SRT1720干预组HIF1α、GLUT1和SNAIL的表达下降；机制研究结果显示，转染Hif1αsiRNA能够抑制高糖诱导的GLUT1和SNAIL的表达；转染Glut1siRNA能够抑制高糖诱导的SNAIL的表达；同时，与高糖组相比，转染Hif1αsiRNA或Glut1siRNA能够抑制高糖诱导的Fibronectin、CollagenIV、α-SMA、GLUT1和SNAIL的表达，增加E-cadherin的表达。
小结SRT1720通过调节SIRT1/HIF1α/GLUT1/SNAIL通路改善糖尿病诱导的肾纤维化。
第三部分SRT1720对缺血再灌注诱导的肾损伤的作用
目的探讨SRT1720对缺血再灌注诱导的肾损伤的影响及作用机制。
方法将8周龄的C57BL/6雄性小鼠，随机分为三大组：假手术组(Sham组)，缺血再灌注组(I/R组)和SRT1720干预组(缺血再灌注小鼠自术前至处死前每天给予50mg/kg的SRT1720灌胃干预，I/R+SRT组)，以上三组再分别以缺血后再灌注的时间长短分为4h、12h、24h、48h、72h、5d和14d共7个时间点小组。至对应时间时取材，检测血尿素氮和血肌酐水平，HE和Masson检测肾组织损伤及胶原沉积，TUNEL染色检测肾细胞凋亡，免疫组织化学检测SIRT1、CD68、F4/80、CollagenI、8-OHdG的表达和定位；免疫荧光检测肾组织中NLRP3的表达，westernblot检测SIRT1、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、NF-κBp65、MCP-1、NOX4、TXNIP、p66Shc、HIF1α、p-p38MAPK、p38MAPK、p-ERK、ERK、p-Smad2/3、Smad2/3的表达。
结果与假手术组小鼠相比，I/R各时间点组小鼠血肌酐和尿素氮均增加，SRT1720干预各时间点组的血尿素氮水平均较I/R组下降；SRT1720干预4h、12h、24h、48h、72h组小鼠血肌酐较I/R组下降，差异具有统计学意义，SRT1720干预5d和14d组小鼠血肌酐水平与I/R5d和14d组无明显差异；与Sham组相比，I/R组12h、24h、48h、72h、5d和14d小鼠肾组织中SIRT1的表达降低；与I/R组24h、48h、72h和14d小鼠相比，SRT1720干预组对应时间点小鼠肾组织中SIRT1的表达增加；与Sham24h组相比，I/R24h组肾细胞凋亡明显增加，Bax/Bcl-2的比率和cleavedcaspase3的蛋白表达增加，CD68或F4/80阳性炎细胞的浸润增加，NF-κBp65、MCP-1、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、8-OHdG、NOX4、TXNIP、p66Shc、HIF1α表达增加，p38MAPK、ERK和Smad2/3信号通路的活化增强；与I/R24h组相比；SRT172024h干预组肾细胞凋亡减少，CD68或F4/80阳性炎细胞浸润减少，NF-κBp65、MCP-1、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、8-OHdG、NOX4、TXNIP、p66Shc、HIF1α的表达降低，p38MAPK、ERK和Smad2/3的活化减弱；此外，与Sham14d组相比，I/R14d组小鼠肾组织胶原沉积和CollagenI表达增加，与I/R14d组相比，SRT172014d干预组肾组织胶原沉积和CollagenI表达均降低。
小结SRT1720改善缺血再灌注诱导的肾细胞凋亡及肾纤维化，这可能是通过调节氧化应激和炎症反应实现的。
结论SRT1720调节肾小管细胞凋亡及肾脏纤维化能够改善糖尿病及缺血再灌注诱导的肾损伤。
第一部分SRT1720对糖尿病肾小管细胞凋亡的作用
目的探讨SRT1720对糖尿病诱导的肾小管细胞凋亡的影响及机制。
方法以10周龄雄性db/db小鼠和同窝对照db/m小鼠为研究对象，随机分为三组：db/m组，db/db组，SRT1720治疗组(给予db/db小鼠50mg/kg/day的SRT1720灌胃治疗)。10周后取材，检测各组小鼠肾功能，PAS染色观察肾组织损伤情况，TUNEL染色检测肾细胞凋亡，免疫组织化学检测肾组织中SIRT1、Bax、Bcl-2、cleavedcaspase3、8-OHdG、NOX4、HO-1、p-p66Shc、Ac-HistoneH3的表达和定位，westernblot检测肾组织中SIRT1、Bax、Bcl-2、cleavedcaspase3、NOX4、HO-1、SOD2、p-p66Shc、p66Shc、Ac-HistoneH3、HistoneH3的表达水平。体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2)，随机分为七组：正常对照组，高糖组，高糖加SRT1720(2.5μM)干预组，高糖加siRNA转染对照组，高糖加p66ShcsiRNA转染组，高糖加NAC干预组，高糖加Tempol干预组。连续培养48h后，TUNEL染色检测细胞凋亡率，MitoSOXRed探针检测线粒体ROS水平，免疫荧光检测SIRT1表达，免疫细胞化学检测p-p66Shc、Ac-HistoneH3表达，westernblot检测SIRT1、p66Shc、p-p66Shc、Ac-HistoneH3、HistoneH3、Bax、Bcl-2、cleavedcaspase3、NOX4、HO-1、SOD2的表达。
结果与db/m组相比，db/db组小鼠肾组织中SIRT1的表达和活性降低，空腹血糖、肌酐、尿素氮及24h尿白蛋白明显增加；与db/db组相比，SRT1720治疗组小鼠肾组织中SIRT1的表达和活性增加，血糖、肌酐、尿素氮、24h尿白蛋白降低，差异具有统计学意义。与db/db组相比，SRT1720治疗组肾细胞凋亡明显减少，Bax、Bcl-2、cleavedcaspase3、8-OHdG、NOX4、HO-1的表达降低，SOD2表达增加；此外，与db/m组相比，db/db组小鼠肾组织中p66Shc、p-p66Shc、Ac-HistoneH3的表达明显增加，SRT1720治疗组p66Shc、p-p66Shc、Ac-HistoneH3的表达较db/db组下降，差异具有统计学意义。体外实验中，与对照组HK-2细胞相比，高糖组SIRT1表达和活性均降低，SRT1720刺激组SIRT1的表达和活性高于高糖组；与高糖组相比，SRT1720刺激组细胞凋亡率下降，线粒体ROS产生减少，Bax/Bcl-2的比率和cleavedcaspase3的表达下降，NOX4、HO-1的表达减少，SOD2的表达增加，p66Shc、p-p66Shc、Ac-HistoneH3表达被抑制；机制研究结果显示，与高糖组相比，抗氧化剂NAC干预组、Tempol干预组、p66ShcsiRNA转染组的细胞凋亡率及线粒体ROS的产生下降，Bax/Bcl-2的比率和cleavedcaspase3、NOX4、HO-1的表达降低，SOD2的表达增加。
小结SRT1720抑制糖尿病或高糖诱导的肾小管细胞凋亡，这可能是通过抑制p66Shc介导的氧化应激实现的。
第二部分SRT1720对糖尿病肾纤维化的作用
目的探究SRT1720对糖尿病诱导的肾纤维化的影响及作用机制。
方法以10周龄雄性db/db小鼠和同窝对照db/m小鼠为研究对象，随机分为三组：db/m组，db/db组，SRT1720治疗组(50mg/kg/daySRT1720灌胃干预db/db小鼠)。10周后取材，Masson染色观察肾组织中的胶原沉积，免疫荧光检测Fibronectin，CollagenIV和GLUT1的表达，免疫组织化学检测E-cadherin、α-SMA、TGF-β1、CTGF、NF-κBp65、HIF1α和SNAIL的表达和定位，westernblot检测E-cadherin、α-SMA、TGF-β1、CTGF、NF-κBp65、HIF1α、GLUT1和SNAIL的表达水平。体外培养HK-2细胞，随机分为六组：正常对照组，高糖组，高糖加SRT1720(2.5μM)干预组，高糖加siRNA转染对照组，高糖加Hif1αsiRNA转染组，高糖加Glut1siRNA转染组。持续培养48h后，免疫荧光检测Fibronectin、CollagenIV、E-cadherin、α-SMA、HIF1α、GLUT1的表达，免疫细胞化学检测SNAIL的表达，westernblot检测Fibronectin、CollagenIV、E-cadherin、α-SMA、HIF1α、GLUT1和SNAIL的表达水平。
结果与db/m组相比，db/db组小鼠肾组织胶原沉积增加，Fibronectin、CollagenIV、α-SMA的表达增加，E-cadherin表达减少，TGF-β1、CTGF、NF-κBp65的表达增加；与db/db组相比，SRT1720干预组肾组织胶原沉积减少，Fibronectin、CollagenIV、α-SMA的表达下降，E-cadherin表达增加，同时，TGF-β1、CTGF、NF-κBp65的表达降低。此外，与db/m组相比，db/db组小鼠肾组织中HIF1α、GLUT1和SNAIL的表达增加；与db/db组相比，SRT1720干预组上述蛋白的表达下降。体外实验中，与对照组HK-2细胞相比，高糖组Fibronectin、CollagenIV、α-SMA的表达增加，E-cadherin表达下降；与高糖组相比，SRT1720干预组Fibronectin、CollagenIV、α-SMA的表达降低，E-cadherin表达增加；此外，与对照组相比，高糖组HIF1α、GLUT1和SNAIL表达明显增加，SRT1720干预组HIF1α、GLUT1和SNAIL的表达下降；机制研究结果显示，转染Hif1αsiRNA能够抑制高糖诱导的GLUT1和SNAIL的表达；转染Glut1siRNA能够抑制高糖诱导的SNAIL的表达；同时，与高糖组相比，转染Hif1αsiRNA或Glut1siRNA能够抑制高糖诱导的Fibronectin、CollagenIV、α-SMA、GLUT1和SNAIL的表达，增加E-cadherin的表达。
小结SRT1720通过调节SIRT1/HIF1α/GLUT1/SNAIL通路改善糖尿病诱导的肾纤维化。
第三部分SRT1720对缺血再灌注诱导的肾损伤的作用
目的探讨SRT1720对缺血再灌注诱导的肾损伤的影响及作用机制。
方法将8周龄的C57BL/6雄性小鼠，随机分为三大组：假手术组(Sham组)，缺血再灌注组(I/R组)和SRT1720干预组(缺血再灌注小鼠自术前至处死前每天给予50mg/kg的SRT1720灌胃干预，I/R+SRT组)，以上三组再分别以缺血后再灌注的时间长短分为4h、12h、24h、48h、72h、5d和14d共7个时间点小组。至对应时间时取材，检测血尿素氮和血肌酐水平，HE和Masson检测肾组织损伤及胶原沉积，TUNEL染色检测肾细胞凋亡，免疫组织化学检测SIRT1、CD68、F4/80、CollagenI、8-OHdG的表达和定位；免疫荧光检测肾组织中NLRP3的表达，westernblot检测SIRT1、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、NF-κBp65、MCP-1、NOX4、TXNIP、p66Shc、HIF1α、p-p38MAPK、p38MAPK、p-ERK、ERK、p-Smad2/3、Smad2/3的表达。
结果与假手术组小鼠相比，I/R各时间点组小鼠血肌酐和尿素氮均增加，SRT1720干预各时间点组的血尿素氮水平均较I/R组下降；SRT1720干预4h、12h、24h、48h、72h组小鼠血肌酐较I/R组下降，差异具有统计学意义，SRT1720干预5d和14d组小鼠血肌酐水平与I/R5d和14d组无明显差异；与Sham组相比，I/R组12h、24h、48h、72h、5d和14d小鼠肾组织中SIRT1的表达降低；与I/R组24h、48h、72h和14d小鼠相比，SRT1720干预组对应时间点小鼠肾组织中SIRT1的表达增加；与Sham24h组相比，I/R24h组肾细胞凋亡明显增加，Bax/Bcl-2的比率和cleavedcaspase3的蛋白表达增加，CD68或F4/80阳性炎细胞的浸润增加，NF-κBp65、MCP-1、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、8-OHdG、NOX4、TXNIP、p66Shc、HIF1α表达增加，p38MAPK、ERK和Smad2/3信号通路的活化增强；与I/R24h组相比；SRT172024h干预组肾细胞凋亡减少，CD68或F4/80阳性炎细胞浸润减少，NF-κBp65、MCP-1、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、8-OHdG、NOX4、TXNIP、p66Shc、HIF1α的表达降低，p38MAPK、ERK和Smad2/3的活化减弱；此外，与Sham14d组相比，I/R14d组小鼠肾组织胶原沉积和CollagenI表达增加，与I/R14d组相比，SRT172014d干预组肾组织胶原沉积和CollagenI表达均降低。
小结SRT1720改善缺血再灌注诱导的肾细胞凋亡及肾纤维化，这可能是通过调节氧化应激和炎症反应实现的。
结论SRT1720调节肾小管细胞凋亡及肾脏纤维化能够改善糖尿病及缺血再灌注诱导的肾损伤。