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运用微量热学的理论和技术对基因工程菌E.coli B1和B2进行了研究,根据热化学的原理对其代谢与生长等生物学过程的热动力学规律进行了解析,从热力学角度探讨了各种不同生长环境(温度、硫酸卡那霉素浓度、Mg<2+>浓度、pH、细胞浓度)对大肠杆菌系统的影响。
因菌种E.coli B1和B2温度诱导的特性,将实验分为两阶段进行:低于诱导温度和高于诱导温度。根据我们得到的不同阶段不同温度变化范围内E.cob B1和B2的热谱曲线,分别拟合出描述低于诱导温度时菌体生长代谢过程的广义Logistic方程和高于诱导温度时的线性生长动力学方程,并计算出低于39℃各种温度下的生长速率常数K、传代时间G、不同生长阶段的发热量Q、热力学参数(活化熵△S<≠>、活化自由能△G<≠>、活化焓△H<≠>及活化平衡常数K<≠>)。拟合K-T方程,并分别确定了E.coli B1的最佳生长温度T<,opt>=36.50℃和在此温度下的生长速率常数K<,opt>=0.0411min<-1>,最低生长温度T<,Low>=4.22℃;E.coli B2的T<,opt>=36.50℃,K<,opt>=0.0425min<-1>,T<,Low>=4.77℃。结果表明,当温度在22~37℃的范围内变化时,细菌生长代谢随温度升高而加快,随温度的降低而变缓,升温有助于细菌的生长,表现出刺激作用。
根据不同浓度硫酸卡那霉素作用下的热谱曲线,拟合得到相应的热动力学方程。并分别用两种不同的模型与定理对其进行分析,研究发现:随着硫酸卡那霉素浓度C的增加,生长速率常数后与产热最大功率P<,m>均降低,但减缓程度不同。当浓度C由0增至2.5μg·mL<-1>,K值变化率最大,降低最快,由0.0596 min<-1>急剧下降至0.0387 min<-1>,继续增加浓度至100μg·mL<-1>,K值变化减缓,且没有添加抗生素药物时的七值总大于有抗生素药物时的K值,所以硫酸卡那霉素对E.coliB1的生长代谢有抑菌作用,且浓度越大,七值越小,抑菌效果越为明显。从lnKC关系式求得药物的半抑制浓度.IC<,50>为88.45 μg·mL<-1>。
采用微量热方法研究了无机盐Mg<2+>对大肠杆菌E coli B1的生长状况的影响,根据产热曲线,分别计算出k,P<,m>和Q的值,结果表明:随着Mg<2+>浓度C的增加,生长速率常数K和最大发热功率P<,m>值均先增大后降低,指数期经历时间t<,D>和稳定期经历时间t<,S>则是先减小后增加。所以存在一个浓度极限值2.2mg/mL,当Mg<2+>浓度在0~2.2 mg/mL的范围内变化时,E.coli B1在有Mg<2+>存在下释放的热量总比没有它存在下释放的热量多,K值随着C的增加而逐渐增大,所以此时Mg<2+>对菌体生长有促进作用;但若继续增加Mg<2+>的浓度至4.4 mg/mL,生长速率常数k反而会降低,促菌效果减弱,且当C在2.75~4.4 mg/mL之间,生长速率常数k值基本不再变化,为一定值。Mg<2+>浓度达到2.2 mg/mL,P<,m>值为最大值53.1μW,且在整个浓度变化范围内,有Mg<2+>存在时的P<,m>总大于没有Mg<2+>存在时的P<,m>。因此从总体效应上看,Mg<2+>表现出对基因工程菌E.coli B1的刺激作用,可促进其生长代谢。并根据实验数据建立了 k-C之间的关系方程,确定了Mg<2+>的最适添加浓度C<,opt>=2.09mg/mL和在此浓度下的生长速率常数k:0.03 84min<-1>。以不同接种细胞浓度的E.coli B1菌液为研究对象,研究了细胞浓度与其生长代谢之间的关系,并获得了相关的热力学信息及热动力学方程,我们发现E.coli B1在培养中存在着由于细胞浓度引起的"空间效应",正是这种"空间效应",使得随着细胞浓度的增加,培养物的发热功率会增加,单细胞的发热功率会减小,但是总的发热量Q却保持不变。接种浓度高时的细胞生长繁殖速率明显高于接种浓度低时的细胞,且k与P<,m>值随C值的升高而增大,呈同向变化关系,分别由0.39×10<7>cfu/mL时的0.0281 min<-1>、40.1μW增大到1.79×10<7>cfu/mL时的0.0425min<-1>、62.8μW。而在相应变化范围内,Q<,log>值和Q<,sta>值则是由126.62 mJ、372.93mJ改变为473.981mJ、30.144 mJ。在整个变化过程中,Q值并没有随细胞初始接种浓度的改变而有太大的变化,基本为一定值,维持在500 mJ左右。实验结论说明随细胞浓度的增加,E.coli B1的生长被激活,即高浓度对细胞活性有刺激作用,有利于细胞的生长代谢。
用微量量热法研究了pH对E.coli B1的生长代谢的影响,建立了描述不同pH作用下产热曲线的广义Logistic方程,并得到k,P<,m>和Q的值,结果可知:若增加pH,生长速率常数k与最高热功率P<,m>都是先增大后减小,所以必然存在一个极限值pH<,opt>。当pH值由6.06增加到6.93时,k、P<,m>与pH的变化趋势一致,它们分别由6.06时的0.0207 min<-1>、33.0μW增加至6.93时的0.0394 min<-1>、59.6μW,菌体生长代谢速率加快,此时表现出促菌生长的作用;若继续增大pH,k、P<,m>与pH的变化趋势就呈相反方向变化,即k、P<,m>值不仅不会随pH的继续升高而增大,反到会出现下降的现象,当增加到8.19时,k、P<,m>值就会由6.93时的0.0394min<-1>、59.6μW减小至8.19时的0.0167 min<-1>、26.1μW,即菌体生长代谢速率减缓,此时表现出抑制作用。拟合k-pH方程,确定了E.coli B1的最佳生长pH值为6.74,此时菌体生长代谢最快,生长速率常数k=0.0407min<-1>。