类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一个以关节滑膜炎症为特点的慢性自身免疫性疾病,它可以导致骨的侵蚀和关节的破坏,最后造成关节畸形,病因迄今仍未被阐明。RA的发病与炎症密切相关,异常的细胞免疫反应和体液免疫反应在疾病发病中起着重要作用。有学者研究表明巨噬细胞在RA发病中至关重要。固有免疫反应是机体防御病原体的第一道防线,炎症小体作为固有免疫的重要组成部分,主要通过模式识别受体(pattern recognization receptors, PRRs)来识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),从而产生免疫应答。PRRs包括位于细胞膜的Toll样受体(TLRs)、位于细胞质的NOD样受体(NLRs)、C型凝集素受体(CLRs)等。NLRP3炎症小体是迄今为止研究最为广泛的由NLR家族组成的炎症小体之一,参与炎症、肿瘤的发病,也在正常生理稳态维持过程中起到重要的作用。佐剂性关节炎(AA)大鼠模型是最为经典的RA动物模型之一,本课题在前期研究中发现,AA模型大鼠血清以及腹腔巨噬细胞体外培养的细胞上清液中IL-1β、 IL-18等炎症因子分泌明显增加(P<0.01)。使用免疫组织化学方法测得AA大鼠滑膜组织中NLRP3炎症小体的三个组分NIrp3、ASC、caspase-1均明显提高(P<0.01)。提示NLRP3炎症小体可能参与AA大鼠的发病。与此同时,前期研究发现AA大鼠腹腔巨噬细胞中的NLRP3炎症小体组分表达增加的同时(P<0.01)而miR-223表达明显降低(P<0.01)。微小RNA(miRNA)是广泛存在于动植物中由21-25个核苷酸构成非编码RNA。有学者研究表明miRNA与许多病理生理过程密切相关,它可识别特定的目的RNA,使之降解或表达下调,参与基因转录后水平调控,从而影响目的基因的蛋白质合成,在细胞分化、凋亡等生理活动中发挥重要的调控作用。本课题组使用双荧光素酶鉴定NLRP3和miR-223存在靶向关系。鉴于AA模型中以及AA模型腹腔巨噬细胞中NLRP3炎症小体各组分以及下游调控的各种炎症因子分泌异常,miR-223表达下调,本课题联系三者的密切相关性,提出科学假设：AA发病中miR-223是否通过调控NLRP3炎症小体的表达从而影响下游细胞因子的分泌?miR-223能否具有缓解AA发病的靶向药物的前景?本课题鉴于Nlrp3以及miR-223的表达在大鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7、THP-1细胞上存在共性,因此,本课题利用RAW264.7巨噬细胞株为工具细胞开展课题研究。研究内容主要包括以下四个部分：1.AA大鼠模型建立以及炎症因子检测从模型建立成功第12天开始,AA大鼠体重较Normal组明显减轻,继发性的足肿胀较Normal组明显增加,但从第28天开始,逐渐出现恢复迹象。病理组织学观察显示,AA大鼠与Normal组相比,滑膜明显增厚,由3-4层甚至更多层滑膜细胞组成,并向关节腔内伸展,骨组织及软骨组织有少量破坏,同时有大量炎性细胞浸润至关节组织,并有少量血管生成。ELISA结果显示,AA组与Normal组相比,血清中的IL-1β、IL-18、IL-22及IL-33的浓度明显升高。免疫细胞化学和免疫荧光检测发现,AA大鼠腹腔灌注提取的细胞呈CD68强阳性,表明提取的细胞为巨噬细胞。ELISA结果显示,AA组大鼠腹腔巨噬细胞上清液中IL-1β和IL-18的浓度明显高于Normal组；2. NLRP3炎症小体与miR-223在AA大鼠中的表达AA大鼠造模成功之后,取AA大鼠滑膜组织与Normal组滑膜组织用免疫组化方法检测,结果表明：AA大鼠滑膜组织中NIrp3、ASC、caspase-1阳性细胞数量明显高于Normal组,且差异具有统计学意义。real-time PCR和western bblot结果显示,AA大鼠腹腔巨噬细胞中NIrp3、ASC、caspase-1 mRNA和蛋白的水平明显高于Normal组,而miR-223表达则降低。提示NLRP3炎症小体与miR-223可能存在调节关联。3.巨噬细胞的筛选与NLRP3炎症小体在RAW264.7细胞株上调控炎症因子分泌本课题组使用LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞、THP-1细胞,ELISA结果显示,IL-1p和IL-18的含量明显高于正常组,real-time PCR结果提示,LPS诱导可以显著降低大鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞、THP-1细胞中miR-223mRNA的水平,同时Nlrp3的mRNA和蛋白水平表达明显增加,其差异具有统计学意义。LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞、THP-1细胞在Nlrp3与miR-223表达上存在共性,因此本课题选用RAW264.7细胞作为工具细胞研究NLRP3炎症小体调控分泌下游炎症因子的分泌。本课题采用LPS、ATP、细胞外高K~+([High] K~+)刺激RAW264.7细胞后,ELISA结果显示,LPS、 ATP单独诱导即可增加细胞上清液中IL-1β、IL-18、IL-33的表达水平,LPS和ATP联合诱导后,IL-1β、 IL-18、IL-33的表达水平更高；而给以[High] K~+后,可明显减少细胞上清液中IL-1β、 IL-18、IL-33的表达；Western blot结果显示,单独给予LPS或ATP诱导以及同时给予LPS和ATP刺激,可显著增加细胞中Nlrp3、ASC、caspase-1蛋白的表达,而给以[High] K~+后,可以明显降低细胞中Nlrp3、ASC、caspase-1蛋白的表达。为了验证Nlrp3在炎症因子分泌过程中的关键作用,使用小RNA干扰技术,沉默nlrp3后,LPS、ATP刺激RAW264.7细胞,ELISA结果显示,沉默nlrp3后,可以明显减少细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达水平,但对IL-33的含量影响较小；real-time PCR和western blot结果显示,给予LPS、ATP诱导后,可显著升高Nlrp3、ASC、caspase-1 mRNA和蛋白的水平,其中以caspase-1增加尤为显著；沉默nlrp3后,NIrp3、ASC、caspase-1 mRNA和蛋白的表达水平降低。提示NLRP3炎症小体是调节炎症因子IL-1p和IL-18等分泌的重要因素。4.miR-223对NLRP3的调控作用为了验证miR-223和N h1rp3相互关系,我们使用双荧光素酶报告显示,miR-223和Nlrp3之间存在靶向关系。使用RAW264.7细胞为工具细胞,LPS诱导可降低正常细胞的miR-223的表达但增加Nlrp3的表达,瞬时转染miR-223 mimics(过表达组)后,可显著提升RAW264.7细胞中miR-223但降低Nlrp3的表达,与NC组相比,mimics组Nlrp3的]mRNA和蛋白水平明显降低；ELISA结果显示,LPS可显著增加RAW264.7细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达水平,转染miR-223 mimics后显著降低IL-1β和IL-18的水平,与NC组相比,mimics组IL-1β和IL-18的表达水平显著降低。LPS诱导可降低正常细胞的miR-223的表达但增加Nlrp3的表达,瞬时转染miR-223 inhibitor(低表达组)后,可显著降低RAW264.7细胞中miR-223但升高Nlrp3的表达,与NC组相比,miR-223 inhibitor组N1rp3的mRNA和蛋白水平明显升高；ELISA结果提示,LPS可明显提高RAW264.7细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达,转染miR-223 inhibitor后IL-1p和IL-18的水平显著升高,与NC组相比,inhibit组亦可显著增加IL-1β和IL-18的表达。为了验证miR-223靶向抑制NLRP3来调节下游炎症因子分泌,课题组瞬时转染mimics且同时沉默Nhp3后,可显著提升RAW264.7细胞中的miR-223但降低Nlrp3的表达；ELISA结果显示,LPS诱导可明显增加RAW264.7细胞上清液中IL-1p和IL-18的水平,转染miR-223 mimics并沉默nlrp3后,可显著降低IL-1p和IL-18的水平,与NC组相比,亦可显著降低IL-1β和IL-18的表达。提示miR-223可能通过调控NIrp3蛋白表达从而影响下游炎症因子分泌,可能是AA大鼠关节炎发病的一个重要环节之一。结论1.AA模型大鼠中miR-223及NLRP3表达异常。2. NLRP3炎症小体可能参与AA的发病过程,调控巨噬细胞炎症因子IL-1p和IL-18的分泌。3.miR-223可抑制NLRP3炎症小体,影响炎症因子IL-1p和IL-18的分泌,可能是AA发病的重要环节之一。