论文部分内容阅读
目的:本项研究基于细胞自噬-铁死亡交互作用的角度,以AMPK/Beclin1/SLC7A11/GPX4为切入点,研究益气活血方对心肌梗死后心室重构可能的保护机制。方法:采用LAD结扎的方法建立大鼠心肌梗死模型。实验分组为假手术组、模型组、益气活血方组、雷帕霉素组、益气活血方联合雷帕霉素组。药物干预12周后,心脏超声评价大鼠心脏结构和功能,苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察大鼠心肌炎性细胞浸润情况、Masson染色观察心肌纤维组织病理改变,免疫组化检测CollagenⅠ、CollagenⅢ表达。透射电镜观察细胞自噬与铁死亡的形态,免疫组化检测心肌组织中自噬标记物LC3与铁死亡标记物FTH蛋白的表达情况。检测血清氧化应激与铁死亡指标MDA与GSH含量水平。蛋白质免疫印迹检测各组大鼠AMPK、P-AMPK、Beclin1、P-Beclin1、SLC7A11、GPX4蛋白的表达。结果:1、造模12周后,相对于假手术组,模型组大鼠的LVEF、LVFS降低（P＜0.01）,LVIDd、LVIDs增高（P＜0.01）,提示模型组大鼠左室扩大,心功能下降;相对于模型组,益气活血方组的LVEF、LVFS升高（P＜0.01）,LVIDd、LVIDs降低（P＜0.05）。提示益气活血方组可减轻心肌梗死所致的大鼠心脏损伤,对心肌的保护作用最显著。HE染色结果显示:假手术组大鼠心肌细胞形态正常,肌丝排列整齐规则,未见炎性细胞浸润;模型组大鼠心肌细胞形态不规则,排列紊乱,炎性细胞浸润增多;相对于模型组,益气活血方组心肌受损较轻,肌丝排列较规则,炎性细胞浸润减少。Masson染色结果显示,假手术组心肌细胞排列整齐,无明显纤维组织增生;模型组显示在心肌梗死边缘区心肌细胞肥大,有大量蓝色胶原纤维沉积,梗死边缘区纤维化面积较大;与模型组比较,益气活血方组蓝色胶原纤维多呈分枝状分布,蓝染面积有不同程度的减少。免疫组化结果显示,与假手术组相比,免疫组织化学染色发现模型组Collagen I表达显著增多（P＜0.05）,Collagen III在模型组中表达存在显著升高（P＜0.01）。与模型组相比,益气活血方组Collagen I与Collagen III表达显著降低（P＜0.05）。提示益气活血方能够抑制心肌纤维化,从而抑制心室重构的发生。2、透射电镜结果显示,假手术组线粒体排列规则,形态正常无自噬小体出现;模型组出现自噬小体与自噬溶酶体,线粒体发生固缩,线粒体嵴消失;相较于模型组,益气活血方组自噬小体形成减少,线粒体排列较规则,无线粒体嵴消失,线粒体形态较正常,而雷帕霉素组肌丝排列严重紊乱,出现自噬溶酶体,线粒体形态大小不等,线粒体固缩更为明显。与雷帕霉素组相比,益气活血方联合雷帕霉素组线粒体形态排列较规则。免疫组化结果显示:与假手术组相比,模型组LC3显著升高（P＜0.01）,FTH表达量显著降低（P＜0.01）,相对于模型组,益气活血方组LC3蛋白表达显著降低（P＜0.01）,FTH表达量显著升高（P＜0.01）,雷帕霉素组LC3表达量显著升高（P＜0.01）,而FTH表达量显著降低（P＜0.05）,与雷帕霉素组相比,益气活血方联合雷帕霉素组LC3蛋白表达显著降低（P＜0.05）,FTH表达量显著升高（P＜0.05）,提示大鼠心肌梗死后出现自噬与铁死亡,而益气活血方能够减轻细胞自噬-铁死亡的发展。血清学检测结果显示,与假手术组相比,模型组MDA含量升高（P＜0.05）,GSH含量显著降低（P＜0.01）,与模型组相比,益气活血方组MDA含量显著降低（P＜0.05）,GSH含量显著升高（P＜0.01）,雷帕霉素组MDA含量增加（P＜0.05）,GSH含量显著降低（P＜0.05）,与雷帕霉素组相比,益气活血方联合雷帕霉素组MDA含量显著降低（P＜0.05）,GSH表达显著增加（P＜0.05）,提示益气活血方可以减轻大鼠心肌梗死后出现的细胞铁死亡现象。3、与假手术组比较,模型组大鼠心肌AMPK、Beclin1磷酸化表达上调（P＜0.01）（P＜0.05）,SLC7A11、GPX4表达下调（P＜0.05）（P＜0.01）,除模型组AMPK表达量较假手术组而言增加（P＜0.05）外,各组AMPK、Beclin1总蛋白表达未见显著差异;与模型组相比,益气活血方组可下调P-AMPK与P-Beclin1蛋白表达（P＜0.05）,上调SLC7A11、GPX4表达（P＜0.05）,而雷帕霉素则能上调P-AMPK、P-Beclin1表达,下调SLC7A11、GPX4表达（P＜0.05）。与雷帕霉素组相比,益气活血方联合雷帕霉素组能够降低P-AMPK、P-Beclin1的表达（P＜0.05）,上调SLC7A11、GPX4表达（P＜0.05）。提示益气活血方能够通过抑制AMPK与Beclin1磷酸化,升高SLC7A11与GPX4的表达抑制心肌细胞的细胞自噬-铁死亡。结论:1、益气活血方能够改善急性心梗后大鼠心功能,降低心肌炎性细胞浸润,减轻心肌纤维化与心室重构。2、益气活血方干预后,线粒体损伤减轻,LC3表达与MDA含量均下降,FTH表达与GSH含量均上升,提示益气活血方可以调节氧化应激与心肌梗死后的自噬与铁死亡的交互作用。3、益气活血方可通过下调AMPK、Beclin1蛋白磷酸化的水平,上调SLC7A11、GPX4蛋白的表达,抑制心梗后的自噬与铁死亡的发生,达到抑制心肌梗死后心室重构的效果。