肝硬化是全球第13位的死亡原因,主要死于肝细胞性肝癌、消化道出血和肝性脑病。随着内镜下套扎、断流术、门体分流术以及抗病毒治疗的发展,肝硬化患者的预期寿命显著延长,进展为肝细胞性肝癌的人数却明显增加。肝细胞性肝癌是我国发病率排名第四,死亡率排名第三的恶性肿瘤,预后极差。寻找预测肝细胞性肝癌发生的分子标志物并采取早期干预措施预防肝癌发生是目前肝细胞性肝癌研究领域的焦点问题。AMPK是由α亚基、β亚基和γ亚基组成的异源三聚体,上游激酶磷酸化AMPKα亚基第172位苏氨酸是其主要激活方式。当细胞能量降低时,会激活AMPK,再通过一些列复杂的调控网络增强产能代谢并同时抑制耗能代谢,从而维持细胞能量稳态,因此,AMPK被认为是细胞“能量调节器”。TAK 1是AMPK的上游活化因子,敲除TAK 1抑制AMPK活化,可导致小鼠自发肝纤维化和肝细胞性肝癌。有氧糖酵解(Warburg效应)是癌细胞的主要代谢方式,敲除AMPKα亚基可促进Warburg效应,加速Myc诱导的淋巴瘤发生。二甲双胍是AMPK的激活剂,长期服用二甲双胍的肝硬化患者肝细胞性肝癌发生率明显降低。同时,AMPK还是治疗纤维化疾病的重要靶点,AMPK激活后可抑制肝星状细胞和巨噬细胞增殖,减轻TAA诱导的小鼠肝纤维化。这些证据表明,AMPK活化发挥了抑制肝纤维化和抑制肿瘤发生的双重作用。但AMPK是否可作为预防和预测肝细胞性肝癌发生的靶分子尚不清楚。探索AMPK在肝细胞性肝癌发生中的作用及机制,可能为临床预防和预测肝细胞性肝癌发生提供新的思路和理论依据。第一部分活化的AMPK对临床肝细胞性肝癌发生的预测作用目的:肝硬化是肝细胞性肝癌发生的高危因素,本部分旨在探索活化的AMPK,既p-AMPK(Thr172),是否可作为预测肝硬化患者肝细胞性肝癌发生的分子标志物。方法:收集我院在门奇断流术中所取的肝活检组织标本,免疫组化检测p-AMPK的表达,采用竞争风险模型分析p-AMPK对肝细胞性肝癌发生的预测作用,并利用四川大学华西医院的独立队列进行验证。结果:共纳入我院426例肝硬化患者作为分析对象,中位随访时间87月,94(22.1%)例p-AMPK低表达,1、3、5和10年肝细胞性肝癌发生率分别为3.1%、9.6%、13.8%和30.6%,332(77.9%)例p-AMPK高表达,1、3、5和10年肝细胞性肝癌发生率分别为0%、0.3%、0.3%和8%。单因素回归分析显示p-AMPK低表达患者发生肝细胞性肝癌的风险明显高于p-AMPK高表达的患者(HR,6.25;95%CI:3.36–11.60;P<0.001),多因素回归分析显示p-AMPK低表达是肝硬化患者肝细胞性肝癌发生的独立危险因素(HR,6.0;95%CI:3.24–11.10;P<0.001)。四川大学华西医院的独立队列中包含132例肝硬化患者,同样发现p-AMPK低表达患者发生肝细胞性肝癌的风险显著高于p-AMPK高表达的患者(HR,8.49;95%CI:2.93–24.6;P<0.001)。p-AMPK低表达是肝硬化患者肝细胞性肝癌发生的独立危险因素(HR,13.4;95%CI:5.14–34.9;P<0.001)。结论:p-AMPK可作为预测肝硬化患者肝细胞性肝癌发生的潜在分子标志物。第二部分活化AMPK可抑制DEN诱导的小鼠肝细胞性肝癌发生目的:AMPK是细胞“能量调节器”,第一部分研究发现p-AMPK低表达是肝硬化患者肝细胞性肝癌发生的独立危险因素,但AMPK活化是否可作为预防肝细胞性肝癌发生的靶点尚不清楚,本部分拟探讨AMPK活化对小鼠肝细胞性肝癌发生的影响。方法:DEN+CCl4法建立小鼠肝细胞性肝癌发生模型,在建模中期取肝活检,免疫组化检测p-AMPK的表达,给予p-AMPK高表达的小鼠AMPK抑制剂(Dor,N=8)或PBS(N=9),给予p-AMPK低表达的小鼠AMPK激活剂(Met,N=7或AICAR,N=6)或PBS(N=7),在建模第32周处死小鼠,观察肿瘤的数目、直径和肝重指数,全自动生化仪检测肝功能血清学指标和血脂指标,天狼星红染色检测肝脏胶原沉积,免疫组化检测α-SMA、F4-80和P62的表达,WB检测ACC、RAGE、DLK-1、CD44、LC3B和P62的表达,透射电镜检测自噬小体的形成情况。结果:(1)p-AMPK高表达的小鼠肝癌数目、直径及肝重指数显著低于p-AMPK低表达的小鼠,肝脏胶原染色面积、活化的肝星状细胞和肝脏巨噬细胞数目更少,肝功能损伤更轻,自噬小体数目更多;(2)在p-AMPK高表达的小鼠,采用Dor抑制AMPK活性可增加肝癌数目、直径及肝重指数,增加小鼠肝脏胶原染色面积,增加活化的肝星状细胞和肝脏巨噬细胞数目,加重肝功能损害,抑制自噬信号通路;(3)在p-AMPK低表达的小鼠,采用Met或AICAR增强AMPK活性可显著减少肝癌数目、直径和肝重指数;缩小肝脏胶原沉积面积,降低活化的肝星状细胞及肝脏巨噬细胞数,改善肝功能,增强自噬;(4)既往研究发现二甲双胍可抑制肝癌发生,其机制与抑制肝脏脂质合成或肝祖细胞增殖有关,而我们的实验结果显示ACC(脂肪酸合成的限速酶)的表达和血甘油三脂在各组之间均没有明显差异;RAGE、DLK-1和CD44(肝祖细胞活化的标志物)的表达在各组之间也没有明显差异,这提示我们可能还有其它机制参与AMPK活化对肝细胞性肝癌发生的抑制作用。结论:AMPK活化可抑制小鼠肝细胞性肝癌发生,但其具体机制仍需进一步探讨。第三部分促进自噬是AMPK抑制肝细胞性肝癌发生的主要机制目的:采用CQ抑制自噬,探索AMPK是否通过调节自噬信号通路抑制肝细胞性肝癌发生。方法:DEN+CCl4法建立小鼠肝细胞性肝癌发生模型,在建模中期取肝活检,免疫组化检测p-AMPK表达,选择p-AMPK低表达的小鼠为研究对象,随机分为3组:Met组(N=8),腹腔注射二甲双胍;Met+CQ组(N=8),腹腔注射二甲双胍和CQ;空白对照(N=8),腹腔注射PBS。在建模第32周处死小鼠,观察肿瘤的数目、直径和肝重指数,全自动生化仪检测肝功能血清学指标,天狼星红染色检测肝脏胶原沉积,免疫组化检测α-SMA、F4-80和P62的表达,WB检测LC3B和P62的表达,透射电镜检测自噬小体的形成情况。结果:(1)Met+CQ组P62的表达明显高于Met组,自噬小体的数目显著低于Met组,但与空白对照组无明显差异,说明CQ成功抑制了自噬信号通路;(2)Met+CQ组肝癌数目、直径及肝重指数高于Met组,与空白对照组无明显差异;(3)Met+CQ组肝脏胶原沉积面积、活化的肝星状细胞及肝脏巨噬细胞数目明显高于Met组,与空白对照组无明显差异;(4)Met+CQ组肝功能血清学指标明显差于Met组,与空白对照组无明显差异。结论:通过CQ抑制自噬,可阻断活化AMPK对肝细胞性肝癌发生的保护作用,自噬可能是活化的AMPK调节肝细胞性肝癌发生的主要下游信号通路。