记忆性T细胞可分为CD4+记忆性T细胞和CD8+记忆性T细胞两种,既往研究表明,这两种T细胞记忆的形成和作用机制有所不同。近些年,对于记忆性CD8+T细胞的研究进展较为迅速,然而对于CD4+T细胞记忆的研究要远远落后,究其原因有两点：(一)抗原特异性的记忆性CD4+T细胞在存活的数量上要远远少于CD8+T细胞。首先,CD4+T细胞的增殖能力远小于CD8+T细胞,这就使得记忆性T细胞前体的数目上,CD4+就要少于CD8+T细胞,而且当抗原被清除后,CD8+记忆性T细胞能够稳态增殖维持一定的数目,而CD+4记忆性T细胞却会因为其他感染、免疫的原因逐渐减少。(二)除了其数目稀少之外,CD4+T细胞记忆内部的异质性也更加显著。辅助性T细胞(CD4+T)在效应阶段就可以根据分泌细胞因子和功能的不同分为Th1、Th2、Treg、Th17等类型,但是并不清楚是否这些效应性细胞都能够产生长期存活并且能够稳态增殖的记忆性T细胞,如果是这样的,那么其形成的方式是否一致。因此对于辅助性CD4+T记忆的研究迫切需要改进实验方法,或者需要建立合理的体外研究体系。 Th17细胞是近两年发现并命名的一类辅助性CD4+T细胞亚群,在分化和功能上有别于Th1和Th2细胞,在自身免疫疾病的发病中起至关重要的作用。Th17的分化需要TGF-β和IL-6的参与和转录因子RORγt的表达,IL-23虽然不能诱导辅助性T细胞向Th17分化,但在Th17的存活和增殖中起到重要作用,而Th1和Th2型的细胞因子,如IFN-γ、IL-4、IL-12等,是可以抑制Th17形成的。然而IL-17在记忆性T细胞中的作用还没有详细的报道,我们想在此方面做一些探索。 一、科学问题的提出目前对于Th17的研究 主要集中在自身免疫性疾病中,它的发现纠正了以往对自身免疫性疾病是Th1反应介导的理论,解释了为什么剔除了IFN-γ,、IFN-γR、IL-12或者STAT1的小鼠实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)和胶原诱导的关节炎(CIA)的发病没有减弱,相反有所增强——Th17细胞才是这些自身免疫性疾病的致病原因。而IL-17作为最初在记忆性CD4+T细胞中发现的细胞因子,其在记忆形成过程中的产生机制,是否能分泌出来,对记忆细胞形成有何影响及其存在的意义等尚不清楚。李斯特细菌感染模型是经典的Th1反应模型,在这种感染环境中,机体内的大多数CD4+辅助性T细胞以分泌IFN-γ为主,但是在免疫记忆形成后,在记忆性CD4+T细胞中却能够发现分泌IL-17的T细胞,据此我们就推测在记忆性CD4+T细胞亚群中是否有这样一群细胞以分泌IL-17为主,那么这群细胞是如何形成的?是由效应阶段的Th17经过T细胞的收缩阶段形成的,还是在记忆形成过程中由其他细胞转化而来的?因为并未有报道在感染的效应阶段检测到Th17的存在,我们设想分泌IL-17的记忆性T细胞是否由分泌IFN-γ的Th1细胞转化而来呢,或者是由其他一群辅助性T细胞分化来?这个分化过程是怎么启动的?有那些因素可以影响它?这群细胞在记忆形成中有什么作用,抑或在记忆性CD4+T细胞的效应阶段发挥怎样的功能?为了回答上述问题,我们开展了本实验研究。 二、研究方法和结果 1、复制体外T细胞静息模型、模拟T细胞记忆形成的实验体系 由于记忆性CD4+T细胞在体内的数量极少,给体内研究带来很大困难,我们首先建立CD4+记忆性T细胞体外分化形成的模型。考虑到体内T细胞的收缩阶段是由于抗原的清除和细胞因子微环境的改变,我们便利用体外撤离抗原刺激和细胞因子诱发T细胞的大量凋亡模拟体内T细胞的收缩阶段。我们首先从DO11.10小鼠脾脏分离得到OVA特异性的CD4+T细胞,体外将之诱导向Th1方向活化,再将活化的T细胞用PBS多次洗涤,彻底去除抗原和细胞因子微环境,在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中静息培养三天,最后收集得到的细胞被称为静息T细胞(rested T cells)。我们发现大多数活化的T细胞会发生活化诱导的凋亡(ACID),到最后只有很少的细胞存活下来。我们检测了这群细胞的表型和细胞因子分泌情况,发现这群细胞在静息的过程中,细胞大小和颗粒度都降低到和初始T细胞相似,下调了表面活化性标记CD25和CD69,上调了CD127、CD27的表达,而黏附分子CD44、CD62L的表达不变,提示其与记忆性T细胞相似性较大。ELISA结果显示用PMA和离子霉素或者抗原再次刺激后6小时内即能够分泌大量的IFN-γ和IL-2,胞内染色也得到类似结果,如此迅速的产生反应正是记忆性T细胞的特征。用CFSE染色检测其增殖能力,结果显示该静息T细胞在抗原再次刺激后较天然T细胞有更强烈的增殖反应,证实这是一类具于记忆细胞功能的体外诱生CD4+T细胞。以上结果表明这种体外体系能够在一定程度上模拟体内记忆性T细胞的形成过程。利用此活化T细胞静息的体系, 我们开展了以下工作。 2、静息CD4+T细胞分泌IL-17,并且不依赖于TGF-β和IL-6 为了研究IL-17在T细胞记忆形成过程中产生及其相关机制,接下来我们检测了各个阶段T细胞IL-17的分泌情况,EUSA和胞内染色结果都表明活化的CD4+Th1细胞不能够分泌IL-17,而静息后CD4+T细胞在PMA和离子霉素或者抗原再次刺激后能够分泌大量的IL-17和IFN-γ；胞内染色结果显示产生两种细胞因子的T细胞没有重叠,即分泌IL-17的CD4+T细胞不分泌IFN-γ,而IFN-γ阳性T细胞也不表达IL-17,两者在CD4+T细胞中的比例均为5-7％。为了进一步证实以上结果,我们设计了体内试验。首先我们在体外用OVA323-339致敏的树突状细胞活化OVA特异性的CD4+T细胞,然后将活化的CD4+T细胞回输到同品系小鼠体内,三天后以CD45.1标记示踪通过FACS分选出体内回输的静息T细胞,分别用PMA和离子霉素或者抗原再次刺激,ELISA的方法检测其细胞因子分泌,结果表明回输的T细胞在体内静息后也能够分泌IL-17。在李斯特菌感染的小鼠模型中也发现效应期的CD4+T细胞不分泌IL-17,而进入到记忆阶段后,记忆性的CD4+T细胞在抗原刺激下却能够产生IL-17。 接下来,我们对记忆性T细胞分泌IL-17的机制进行研究和探讨,试图阐明Th17分化必须的细胞因子TGF-β和IL-6在其中的作用。在效应性T细胞的静息过程中检测到一定量的IL-6和TGF-β前体,而没有活性形式的TGF-β。在静息过程中阻断TGF-β和IL-6对静息后的T细胞分泌IL-17没有影响,初步提示这两个细胞因子可能在其中不发生作用,可能存在另外的机制导致了IL-17的分泌。 对于记忆性T细胞分泌IL-17的功能意义及其机制还有待进一步的研究。既然在活化阶段并没有产生IL-17,而在记忆阶段却能够分泌IL-17,我们推测可能在CD4+T细胞记忆的形成过程导致了IL-17的分泌潜能。在活化T细胞的静息阶段,许多与T细胞效应相关的基因被关闭,而与记忆相关的基因被打开。细胞生长和凋亡分子也发生了巨大变化,一些生长细胞周期调节蛋白,比如Akt1、cyclins、CDKs以及caspases、颗粒酶等迅速下调。既往研究表明,这个转变的过程很可能是一种效应性T细胞内在的程序化过程,那么是不是还有一些因素是这个程序化过程所必须的,或者有什么因素可以调节影响这个过程呢?IL-17在静息后T细胞中或者说记忆性T细胞中的表达是否也是此程序中的一步?是不是有某种外在因素的作用导致了记忆形成中一部分CD4+T分泌IFN-γ,而另一部分分泌IL-17?而IL-17作为联系特异性免疫和固有免疫的中介,在记忆性T细胞的激活阶段分泌,是否是仅仅为了募集大量的中性粒细胞,帮助机体迅速清除感染,抑或还有其他未明的功能,这些都有待于后面的研究。 综上所述,建立了CD4+记忆性T细胞形成的体外研究模型,并且从表型和细胞因子分泌角度以及通过体外和体内实验验证了这种模型的合理性和可行性。在此基础上,我们发现在效应阶段T细胞以分泌。IFN-γ为主,并不分泌IL-17,而通过一个静息的过程形成记忆样CD4+T细胞后在抗原再刺激下能够分泌大量IL-17;初步的研究表明在诱导Th17细胞分化过程中发挥重要作用的TGF-β和IL-6在静息CD4+T细胞分泌IL-17的过程中没有作用,提示可能存在有待进一步探索的其它机制。该研究有助于更加深刻的理解免疫记忆形成的机制和过程,为免疫应答的调控、预防性和治疗性疫苗的研发和策略提供理论依据。