烟草（Nicotiana tabacum）是一种喜温的经济作物,低温会影响烟草生长发育,导致产值、产量降低。在遇到寒冷的天气条件下,烟草可通过产生绿原酸等多酚类化合物来适应外界环境的变化,多酚类化合物的积累可以一定程度上缓解低温对烟草的伤害。前期我们发现Nt MYB4a的表达受低温诱导,且转基因实验证明Nt MYB4a参与绿原酸生物合成,但低温条件下Nt MYB4a参与绿原酸生物合成的功能及其分子机制尚不清楚。因此,本研究拟以Nt MYB4a过表达和CRISPR/Cas9敲除烟草株系及其野生型（GDH88）为材料,对烟草幼苗进行4℃低温胁迫处理,然后采用植物生理学、分子生物学、转录组学和代谢组学等技术测定绿原酸含量及其合成代谢途径相关酶活性、Nt MYB4a及绿原酸合成代谢相关基因表达量、差异表达基因和差异代谢物等指标的差异变化规律,明确低温诱导NtMYB4a参与绿原酸生物合成的功能,并解析其分子机制。为通过低温信号促进Nt MYB4a调控绿原酸合成,从而为提高烟草品质及耐低温的改良奠定基础。主要结果如下:1.低温胁迫后,烟草叶片萎焉,细胞膜损伤导致相对电导率增加,但过表达NtMYB4a株系中叶片萎焉程度、相对电导率较低,且脯氨酸、叶绿素含量较高,说明Nt MYB4a具有提高烟草耐低温特性的功能。受低温诱导后,各株系的绿原酸含量、PAL酶活性、HCT酶活性较对照均有所升高,Nt MYB4a及绿原酸代谢相关基因的表达水平均上调,表明低温可诱导Nt MYB4a及绿原酸相关基因表达上调、相关酶活性增加,从而促进绿原酸的合成。2.从转基因株系和野生型株系的差异表达基因中筛选到51个NtMYB4a候选下游靶基因,其中5个与苯丙烷代谢途径相关。常温下的30个候选靶基因分别富集到多细胞生物发育、硫酸盐同化、运输等11个生物过程,DNA结合、ATP活性、几丁质酶活性等11个分子功能,细胞核、细胞壁等5个细胞组分,并注释到嘧啶代谢、烟酸和烟酰胺代谢等9个代谢通路;低温胁迫下的21个候选靶基因分别富集到氧化还原过程、去除超氧自由基、碳水化合物代谢过程等12个生物过程,核苷酸结合、L-抗坏血酸结合、柚皮素3-双加氧酶活性等16个分子功能和细胞核、细胞质、叶绿体等7个细胞组分,并注释到过氧化物酶体、RNA降解、黄酮类生物合成、淀粉和蔗糖代谢、氰基氨基酸代谢等8个代谢通路。3.对转基因株系和野生型株系进行代谢组检测,48个材料一共检测到623种代谢物。对比分析转基因和野生型株系的差异代谢物,发现常温下过表达Nt MYB4a可能正向调控N2-γ-谷氨酰胺、焦谷氨酸、戊二酸等羧酸及其衍生物类化合物积累;低温下过表达Nt MYB4a则正向调节烟叶中D-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸、苏糖酸等有机氧化物积累。关联转录组分析筛选到的候选靶基因,表明Nt MYB4a可能通过调控gene＿28342、gene＿80672、gene＿60014、gene＿30701和gene＿19221等基因的表达,通过谷胱甘肽代谢途径、芪类,二芳基庚烷类和姜酚生物合成、黄酮类生物合成、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢及氰基氨基酸代谢等代谢途径,促进谷胱甘肽、脱氢抗坏血酸、苯丙氨酸、绿原酸和蔗糖等化合物的合成,从而提高烟苗对低温的抵御能力。4.在本研究中,烟草绿原酸合成主要途径为HCT催化对-香豆酰奎尼酸的合成,随后经C3H羟基化作用生成绿原酸。常温下过表达Nt MYB4a烟草中绿原酸含量与野生型无显著差异,但受低温胁迫后,过表达Nt MYB4a烟草中绿原酸含量,4CL、HCT基因的表达水平及酶活性都显著高于野生型。进一步从转录组中鉴定到两个参与绿原酸合成的关键酶基因gene＿40941（4CL）和gene＿30701（HCT）是低温下Nt MYB4a调节的候选靶基因;此外,HCT催化合成的对-香豆酰圭尼酸无论在常温还是低温下,在过表达Nt MYB4a中的含量都显著高于野生型和敲除株系;常温下该物质含量在野生型和敲除株系中没有明显差异,但受低温胁迫后野生型中对-香豆酰圭尼酸含量显著增加,敲除株系中含量则减少。这些结果表明:Nt MYB4a响应低温胁迫调控HCT的上调表达,催化生成对-香豆酰圭尼酸,从而促进绿原酸的合成。