论文部分内容阅读
朊病毒病(priondisease)又称可传播性海绵状脑病(Transmissiblespongiformencephalopathies，TSEs)是一类人畜共患的慢性致死性中枢神经系统退行性疾病，包括人类的库鲁病(Kurudisease)、克-雅氏综合征(Creutzfeldt-Jakobdisease，CJD)、格斯特曼综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinkersyndrome，GSS)和家族性致死性失眠征(fatalfamilialinsomnia，FFI)；动物的羊瘙痒病(Scrapie)，疯牛病(bovinespongiformencephalopathy，BSE)及鹿的慢性消耗退行性疾病等。在来源上有自发性、遗传性和感染性三种形式。
在人类的prion疾病中约10～15％是与遗传有关，包括家族性CJD和所有的GSS和FFI患者，为常染色体显性遗传病，与20号染色体上的PrP基因(PRNP)的点突变、插入或缺失突变有关。其中插入或缺失突变多发生在PRNP基因的八肽重复区，并且已经证实1～9个额外八肽重复的插入与家族性prion疾病有关。近来发现快速进展的痴呆综合征与PRNP基因中两个八肽重复的缺失有关。目前很多证据表明朊病毒病是由细胞内的正常朊蛋白PrPC转变为具有感染性和蛋白酶抗性的PrPSc引起。PRNP基因的突变可能有助于PrPC向PrPSc的自发转化，但是遗传性朊病毒病的致病机理尚不清楚。Harris等构建了一种人类遗传性朊病毒病的转基因小鼠模型，能够表达具有额外九个八肽重复区的PrP蛋白，这种小鼠患上了一种慢性进行性神经功能紊乱性疾病，主要临床表现为小脑共济失调，神经病理学上的改变是PrP蛋白突触样沉积，胶质细胞增生及小脑颗粒细胞的丢失。为了研究八肽重复数目在遗传性朊病毒病中的作用，我们利用PCR突变技术构建了一系列含有不同数目八肽重复序列的PrP突变体，其中包括2个八肽重复缺失，及4、6、10个八肽重复插入的突变体。在此基础上我们构建了各种全长的PrP真核细胞表达重组质粒，瞬时转染体外培养细胞后，用MTT方法观察这些突变体对细胞生长的影响作用。
实验结果显示野生型PrP及突变体均能在HeLa细胞中得到一定水平的表达。转染野生型PrP表达质粒对HeLa细胞的生长增殖无明显的影响，而不同突变体对细胞增殖均有微弱的毒性作用，对不同时间点各组MTT测定值变化趋势的分析显示出明显的一致性，在12h时即出现降低变化，但在36h和48h更为明显，并且随着八肽重复序列数目的增多，毒性作用增强。缺失两个八肽重复序列的突变体对细胞也有一定的毒性作用，而且对其MTT绝对值的分析显示其毒性作用甚至要强于huPrP(PG11)。这些结果提示在本研究体系中，带有八肽重复序列的插入或缺失PrP突变体可引起一定的细胞毒性作用。