家蚕的表皮覆盖在其整个身体表面,参与了防止病原微生物的入侵、物理损伤、脱水等生理功能。表皮在家蚕发育过程中对其体形的塑造、维持正常活动能力是必不可少的,极大地增强了家蚕的生存和适应外界环境的能力。家蚕几丁质结合蛋白作为表皮中重要的结构蛋白,参与了其蜕皮、变态发育等过程。几丁质结合蛋白广泛地存在于昆虫表皮、围食膜当中,它可以与几丁质相互结合形成复合物,参与昆虫表皮和围食膜结构的形成。本研究主要通过生物信息分析、基因克隆、原核表达、Western Blot、免疫荧光、RNAi等方法对家蚕体内的几丁质结合蛋白(BmCBP)进行鉴定,并对其在家蚕体内的分布及表达调控方式进行探究,为深入研究几丁质结合蛋白在家蚕变态发育中的作用提供支持。主要研究结果如下:1、家蚕几丁质结合蛋白的鉴定、及表达分析利用已报道的含有ChtBD2结构域几丁质结合蛋白氨基酸序列检索家蚕全基因组数据库和NCBI数据库,共鉴定到46个含有ChtBD2结构域的编码蛋白,并分类命名为四个家族,分别包括26个围食膜因子相似蛋白(CPAPs),13个围食膜蛋白(PMPs),4个几丁质酶(CHT)和3个几丁质去乙酰化酶(CDA)。对各家族ChtBD2结构域进行同源性分析,发现均含有6个高度保守的半胱氨酸,且包含50到63个氨基酸残基数不等,各家族的半胱氨酸的间隔数没有明显区别。对上述鉴定到的蛋白通过基因芯片数据分析发现,该家族的组织表达模式可以分为2类,其中第Ⅰ类主要在头部、表皮高量表达;第Ⅱ类主要在中肠高量表达。2、家蚕几丁质结合蛋白克隆、表达、纯化及抗体制备对其中鉴定到两个编码几丁质结合蛋白的基因,分别命名为BmCBP1和BmCBP2,其中BmCBP1编码237个氨基酸,成熟体大小约为26.4 kDa,等电点约为4.9;BmCBP2编码227个氨基酸,成熟大小约为25.7 kDa,等电点约为4.6,两者均含有三个富含半胱氨酸的ChtBD2结构域。进化分析发现BmCBP1和BmCBP2可能在家蚕中存在较早的分化。对BmCBP1和BmCBP2基因进行克隆、表达,对其表达形式分析发现BmCBP1主要以包涵体形式表达,BmCBP2的主要以可溶性形式表达,进一步对可溶性表达的BmCBP2其进行纯化,得到的高纯度蛋白并制备多克隆抗体。效价检测显示BmCBP2的抗体效价高于1:512,000,浓度为1.60 mg/ml,抗体特异性检测显示BmCBP2的多克隆抗体可与抗原特异性结合,制备的抗体可用于后续实验。3、家蚕几丁质结合蛋白的表达特征及组织定位核酸水平检测家蚕5龄第3天各组织以及各时期BmCBP1和BmCBP2的表达情况。RT-PCR及Q-PCR结果显示,BmCBP1、BmCBP2均主要在头部、表皮中表达量较高。时期表达特征结果显示,BmCBP1、BmCBP2主要在上蔟时期以及蛹末期高量表达。进一步在蛋白水平检测BmCBP2家蚕预蛹期各组织及各时期表达,预蛹期各组织表达谱显示BmCBP2主要在头部、表皮中有高量表达,而时期表达特征结果显示BmCBP2在眠期和变态发育期上调表达,蛋白水平Western Blot检测结果基本与核酸水平相一致。通过蜕皮激素注射家蚕,Q-PCR检测发现BmCBP2受到蜕皮激素的诱导上调表达。免疫荧光结果显示,几丁质主要定位在家蚕体壁的表皮层,BmCBP2则存在于家蚕体壁的表皮层和皮细胞层。进一步通过免疫荧光对家蚕体壁4龄眠期不同时间点BmCBP2蛋白和几丁质定位发现,BmCBP2蛋白参与家蚕4龄眠期新表皮的形成过程。4、BmCBP2蛋白功能初探将可溶性的重组BmCBP2与几丁质珠共同孵育,通过Western blot检测,结果显示BmCBP2蛋白能与几丁质特异性结合,进一步验证该蛋白与几丁质互作,参与家蚕表皮的形成;构建了带有GST标签的BmCBP2基因表达载体,利用GST-pull down对BmCBP2蛋白进行了体外互作蛋白的研究,经质谱鉴定为CP8precursor等蛋白,还需要进一步实验验证。当利用蜕皮液与BmCBP2蛋白共同孵育,发现蜕皮液中存在蛋白酶能够特异性降解BmCBP2蛋白。通过RNAi干涉4龄眠期BmCBP2基因的表达,在核酸水平检测成功下调BmCBP2基因的表达,然而在表型上并没有明显的变化,推测与BmCBP2基因在眠期持续性高表达有关,以上结果为进一步研究该蛋白的功能提供了重要研究线索。