PzIPT1在雄配子中表达的分子机理及细胞分裂素调控雌配子体发育的研究

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被子植物的雌雄配子体发育、双受精和胚胎发育等有性生殖过程是它们进行世代交替的关键。成熟花粉粒是被子植物的雄配子体,拟南芥成熟花粉粒包含一个营养细胞和两个精细胞。过去十多年的研究表明精细胞具有丰富的基因表达,而且精细胞表达的转录本对精细胞的发育、分化以及双受精后胚胎的正常发育至关重要。但是迄今为止,对精细胞基因表达调控的研究非常有限。拟南芥的雌配子体是由功能性大孢子经过三次有丝分裂发育形成的七细胞八核结构,包含珠孔端的两个助细胞、一个卵细胞、两个极核和合点端的三个反足细胞。细胞分裂素参与调节植物生长发育的各个阶段,然而它调节雌配子体发育的分子机理至今仍很不清楚。我们鉴定到一个在白花丹(Plumbago zeylanica)Svn精细胞中特异表达的异戊烯转移酶基因(PzIPT1),并克隆到其启动子,发现该启动子可以启动报告基因在拟南芥成熟花粉粒的两个精细胞中表达。启动子截短实验表明,该启动子含有至少两类顺式调节元件,能够精确调控报告基因在精细胞而不是营养细胞中的表达以及表达强度。其中一个顺式调节元件是细胞分裂素依赖性蛋白结合位点(CPB),用100nM的细胞分裂素处理包含该位点的转基因植株?130::GFP和?154::GFP的花粉15分钟、30分钟、45分钟、60分钟都可以增强报告基因在精细胞中的表达;120分钟之后,表达又减弱;用花粉活性培养基洗去外源施加的细胞分裂素,再用细胞分裂素处理15分钟又可以增强报告基因在精细胞中的表达;但是,用细胞分裂素处理特异性删除CPB位点的转基因植株?89-95::GFP的花粉,报告基因的表达却没有任何变化。另外一类顺式调节元件是两个相同的6-bp雄配子选择激活基序(MGSA)。特异性删除MGSA基序后,报告基因在精细胞中不表达,但不影响在其他孢子体组织中的表达。多个重复的MGSA基序结合35S启动子的基本序列可激活报告基因在精细胞中表达。生物信息学分析在拟南芥中鉴定到37个包含两个MGSA位点且在精细胞中表达的基因,并验证了6个基因在精细胞中的表达,破坏任何一个MGSA位点即会影响这些基因在精细胞中的表达,这说明顺式调节元件MGSA对于植物精细胞基因表达调控具有一定的普遍性。构建了花粉cDNA文库,通过酵母单杂交文库筛选寻找MGSA位点的结合蛋白,鉴定到更多可能调控精细胞基因表达的基因,为今后进一步深入研究被子植物精细胞的基因表达调控机理奠定了基础。另一项研究构建了胚囊中细胞分裂素水平降低的突变体ES::CKX1和胚囊中细胞分裂素水平升高的突变体ES::IPT1,它们都是败育的。显微观察发现它们的胚囊发育滞后,当正常胚囊发育至二核期时,ES::CKX1和ES::IPT1的部分胚囊发育停留在单核期;当正常胚囊发育至四核期时,ES::CKX1和ES::IPT1的部分胚囊发育停留在单核和二核期;当正常胚囊发育至八核期时,ES::CKX1和ES::IPT1的部分胚囊发育停留在单核、二核或四核期。拟南芥雌配子体的发育需要经过三次完美无瑕的有丝分裂过程,由一系列的细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶调控。细胞周期相关基因的表达模式分析发现很多调控细胞周期进程的基因在ES::CKX1和ES::IPT1中与在野生型背景中相比较发生了差异表达,例如G2期检验点周期蛋白依赖性蛋白激酶CDKA;1、CDKB2;1、CDKB2;2在ES::CKX1和ES::IPT1胚囊中下调表达;而在G2期进入M期须降解的周期蛋白CYCB1;1在ES::CKX1和ES::IPT1胚囊中上调表达;细胞分裂素响应基因ARR10、ARR12和ARR18也在ES::CKX1和ES::IPT1胚囊中下调表达。这些结果说明,细胞分裂素对于拟南芥雌配子体的发育是必不可少的,它通过影响细胞周期中重要的周期蛋白和周期蛋白依赖性蛋白激酶的表达从而影响胚囊中细胞的分裂。
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