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制川乌-白芍药对为临床上常用药对,主要用于风湿痹症的治疗。目前多从化学成分、药理效应的角度,阐明制川乌-白芍配伍机制,且给药方式多为口服给药。现代生物药剂学研究表明,中药成分在体内的“代谢”,以及中药成分对肌体“代谢”的调节作用,也是中药发挥疗效的重要环节。药对中成分进入体内,不仅可影响药物代谢酶的活性,进而影响药对中成分的代谢,还可能“干预”肌体内源性物质代谢,使肌体“回调”到平衡状态,而发挥治疗作用。因此,“代谢”也可能是阐述药对配伍机理的切入点。同时,临床已证实,经皮给药是治疗疼痛、炎症等风湿痹证最常用、有效的给药方式之一。药对中成分可能调节皮肤中药物代谢酶的活性,促进或抑制药物的代谢,从而影响药物的吸收。因此,本项目采用经皮给药方式,研究制川乌-白芍配伍对“药物代谢”和“代谢组学”的影响,从“代谢”的角度探讨制川乌-白芍药对“增效减毒”作用机理。主要研究内容如下:1制川乌-白芍配伍对药物代谢的影响1.1制川乌-白芍配伍对皮肤及肝微粒体中CYP450活性的影响以SD大鼠为实验对象,分别连续经皮给予制川乌、白芍、制川乌-白芍配伍凝胶剂14天后,采用探针底物与皮肤、肝微粒体体外孵育方法,通过HPLC检测皮肤微粒体中1种探针底物及肝微粒体中4种探针底物的浓度,计算代谢速率,考察各给药组对大鼠皮肤及肝CYP450活性的影响。结果显示,与正常组比较,白芍、制川乌对皮肤中的CYP3A4活性具有明显的抑制作用(P<0.05);与白芍单用组比较,白芍配伍制川乌后CYP3A活性显著下降(P<0.05);与制川乌单用组比较,制川乌配伍白芍后CYP3A4的活性显著增加(P<0.05)。与正常组比较,白芍、制川乌对肝脏中的CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2E1都具有明显的抑制作用(P<0.05);与制川乌、白芍单用组比较,配伍后CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2E1活性均明显增加(P<0.05)。结果表明,制川乌、白芍均为CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2E1的抑制剂,两药配伍后改变了皮肤、肝脏中药酶的活性,导致药物代谢速率发生改变,进而发挥“增效减毒”作用。1.2制川乌-白芍配伍对肝微粒体中6个酯型生物碱代谢的影响以SD大鼠为实验对象,分别连续经皮给予制川乌、白芍、制川乌-白芍配伍凝胶剂14天后,采用肝微粒体体外孵育方法,通过HPLC测定孵育体系中6个酯型生物碱的浓度,计算代谢速率,考察各给药组对6个酯型生物碱在肝微粒体中代谢速率的影响。结果显示,与正常组比较,白芍、制川乌单用组6个生物碱的代谢速率均显著下降(P<0.05),表明白芍、制川乌对6个生物碱的代谢具有明显的抑制作用(P<0.05);与制川乌单用组比较,制川乌配伍白芍后6个生物碱的代谢速率显著增加(P<0.05),表明配伍后增加了制川乌6个生物碱的肝脏代谢,这可能是配伍“减毒”机理之一。1.3制川乌-白芍配伍对肝微粒体中芍药苷(Paeoniflorin,PF)代谢的影响以SD大鼠为实验对象,分别连续经皮给予制川乌、白芍、制川乌-白芍配伍凝胶剂14天后,采用体外孵育方法,通过HPLC-MS/MS测定孵育体系中PF的浓度,计算代谢速率,考察各给药组对PF在肝微粒体中代谢速率的影响。结果显示,与正常组比较,白芍、制川乌对肝脏中PF的代谢有明显的抑制作用(P<0.05);与白芍单用组比较,白芍配伍制川乌后芍药苷的代谢速率明显增加(P<0.05)。综合配伍对皮肤中CYP3A4活性的调节作用,制川乌-白芍配伍对PF代谢速率的综合影响,可能由吸收阶段皮肤组织中CYP3A4的活性和消除阶段肝脏组织中CYP3A4的活性共同决定。2.制川乌-白芍配伍对代谢组学的影响以雄性SD大鼠为实验对象,建立关节炎模型后,分别连续经皮给予制川乌、白芍、制川乌-白芍配伍凝胶剂21天,首先采用酶联免疫吸附法(ELISA),检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)及炎症因子白介素-1β(IL-1β)的含量。结果显示,制川乌能显著降低血清中TNF-α及IL-1β的含量(P<0.05);白芍能显著降低血清中TNF-α的含量(P<0.05),IL-1β的含量有下降趋势;与白芍单用组比较,白芍配伍制川乌后血清IL-1β与TNF-α含量显著下降(P<0.05),表明制川乌、白芍能一定程度的缓解炎症,且两药配伍后疗效更佳。采用UPLC-Q-TOF-MS技术获得关节炎大鼠的粪便代谢物图谱,应用主成分分析PCA、最小二乘判别分析PLS-DA,根据重要性变量VIP、P值,筛选并鉴定与关节炎相关的潜在生物标志物。结果显示,胆酸、甘氨胆酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、亮氨酸、溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine,LPC(18:1(9Z)))等6个差异代谢物,可能是制川乌-白芍药对配伍治疗关节炎的潜在代谢标志物。这些标志物分别位于初级胆汁酸生物合成、α-亚麻酸代谢、缬氨酸,亮氨酸及异亮氨酸的生物合成、甘油磷脂代谢等4条代谢通路上。6个差异代谢物在各组中的相对含量结果显示,与正常组比较,模型组中胆酸、甘氨胆酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、亮氨酸的相对含量均降低,LPC(18:1(9Z))的相对含量升高;与模型组比较,制川乌、白芍、制川乌白芍配伍均可“回调”上述代谢产物的含量;与制川乌、白芍单用组比较,配伍组中胆酸、甘氨胆酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸的相对含量均显著增加,并向正常组趋近。结果表明,制川乌白芍配伍可通过“干预”肠道菌群代谢、α-亚麻酸代谢、能量代谢、甘油磷脂代谢通路,而发挥“增效”作用。本项目从代谢的角度,研究制川乌-白芍配伍对药物代谢及代谢组学的影响,阐述了制川乌-白芍配伍的“增效减毒”机理,对制川乌-白芍药对的临床合理应用具有一定的指导意义,为中药药对配伍机制研究提供了新的思路。