第一部分AML患者骨髓微环境中交感神经病变及Th相关分子异常的作用及机制研究研究背景:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种造血系统的恶性疾病,表现为骨髓中异常原始细胞和幼稚细胞的过度增殖,抑制骨髓正常的造血功能,并广泛浸润肝、脾等脏器为特征,平均生存期短,严重威胁着人类健康。随着现代医学科学的迅速发展,AML的治疗效果有了明显改善,许多患者的病情可以获得缓解,但其无病生存期及总体生存率并没有明显得到提高,部分完全缓解的患者也会复发成为难治性白血病。因此我们还需要继续深入研究AML的发病机制,寻找更有效地治疗策略,努力改善患者的预后。研究发现,骨髓造血微环境(hematopoietic microenvironment,HM)的改变与多种血液恶性疾病的发生发展密切相关,近年来针对骨髓微环境与白血病细胞之间相互作用的研究成为研究热点。骨髓造血微环境主要由骨髓内的基质细胞、细胞外基质以及各种细胞因子构成。近年的研究又发现骨髓神经组织也是骨髓微环境的重要组成部分,骨髓神经组织由交感神经系统(Sympathetic Nervous System,SNS)纤维,成髓鞘Schwann细胞、非成髓鞘Schwann细胞和nestin阳性的间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)组成。骨髓神经组织对维持骨髓的正常造血功能具有重要作用,骨髓局部区域中交感神经纤维可以通过支配骨髓小动脉,调节造血干细胞(Hematopoietic Stem Cells,HSCs)的迁移,在骨髓造血与免疫中发挥重要作用;Schwann细胞是周围交感神经系统的主要胶质细胞,是骨髓区域微环境的重要组成成分;而骨髓中nestin阳性的间充质干细胞在SNS纤维及Schwann细胞的调控支配下,能够维持HSCs的存活和扩增。骨髓神经组织不仅在正常骨髓造血和细胞免疫功能中发挥重要作用,骨髓神经组织损伤则能引起造血微环境的改变,损害正常造血功能,促进血液系统疾病的发生、发展。有动物实验研究证实,化疗引起的小鼠骨髓神经损伤是影响骨髓造血功能恢复的重要原因,放疗或者化疗时应用神经保护措施,会有利于骨髓造血功能的恢复。虽然有研究发现骨髓中交感神经纤维的病变会促进AML小鼠骨髓中白血病细胞的浸润,但尚未揭示骨髓神经组纤维病变的作用机制。因此,AML患者的骨髓神经组织是否存在病变,如果存在骨髓神经损伤,在AML发生发展中的作用机制,亟待进一步研究。研究目的:本研究拟通过对比检测AML患者和正常对照组骨髓组织中神经相关分子的表达水平变化来探究AML患者的骨髓微环境中是否存在骨髓神经组织病变;分析神经相关分子表达水平与患者临床特征和预后的相关性;检测辅助性T细胞(T helper,Th)相关分子的表达变化,初步探讨骨髓神经病变在AML中的作用机制。研究方法:1.实验分组:AML组为新诊断AML患者100例,对照组为肿瘤学及炎症免疫学方面无异常的缺铁性贫血患者55例。2.治疗和随访:AML(非M3型)采用标准DA或IA方案诱导治疗,获得完全缓解后,以蒽环类药物联合标准剂量阿糖胞苷或大剂量阿糖胞苷序贯强化治疗。APL(M3型)的治疗则先应用全反式维甲酸士联合化疗进行诱导缓解,完全缓解后继续以蒽环类药物联合标准剂量阿糖胞苷或亚砷酸巩固化疗。电话随访并结合住院或门诊病历随访患者总生存期(overall survival,OS),即确诊之日至死亡或末次随访的时间,随访截止日期为2015年10月31日,中位随访时间为15.5个月(2.0月～34.0月)。3.骨髓神经组织相关因子的检测:应用免疫组织化学技术和定量RT-PCR技术,检测AML患者和对照组骨髓组织中nestin、GFAP、TH和S100B在蛋白和基因水平的表达情况,通过对两组表达率和表达强度进行统计,分析AML患者骨髓神经相关分子表达的变化;将神经相关分子的表达水平与AML患者临床病理特征和预后进行相关性分析,探讨神经病变与AML患者预后的关系;应用ELISA方法,检测AML患者和对照组骨髓上清中神经多肽Y(neuropeptide Y,NPY)和去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)的分泌情况。4.辅助性T细胞相关分子的检测:应用免疫组织化学技术和定量RT-PCR技术,检测AML患者和对照组骨髓组织中Th细胞相关的IL-17和Foxp3在蛋白和基因水平的表达情况;将神经相关性分子和Th细胞相关分子的表达水平进行相关性分析,探讨两者之间的关系。研究结果:1.AML患者骨髓组织神经相关分子的蛋白水平表达下降1.1我们共收集60例AML患者和35例正常对照骨髓活检标本。采用免疫组织化学染色法(IHC)检测神经相关分子标志物nestin、TH、S100B和GFAP的蛋白表达水平。以染色指数(SI)4分为界,≥4分为高表达,<4分为低表达。1.2 AML患者骨髓组织中nestin和TH的高表达率显著低于对照组,而S100B的高表达率在AML患者和对照组之间并无统计学差异。至于GFAP,我们发现在AML组无阳性表达,对照组有2例阳性表达(2/20)。1.3研究了神经相关分子在骨髓组织的高表达率后,我们又进一步分析了他们的表达水平。AML患者nestin和TH的表达水平较对照组明显降低,S100B蛋白表达水平在AML患者和对照组之间无统计学差异。2.AML患者骨髓神经相关分子的mRNA表达水平下降2.1我们共收集了 40例AML患者和20例正常对照的骨髓及上清标本,定量RT-PCR方法检测nestin、TH、S100B和GFAP的mRNA表达水平。2.2我们发现,与免疫组化的结果相一致,AML患者骨髓中nestin和TH的mRNA表达水平明显低于对照组。GFAP在AML组和对照组的mRNA水平均很低,但差异仍有统计学意义。S100B在AML组的mRNA水平比较稍有下降,但并无统计学意义。3.AML患者骨髓交感神经递质的分泌减少我们采用ELISA方法检测了 40例AML患者和20例正常对照的骨髓上清中神经递质NPY和NE的浓度,发现AML患者骨髓上清中NPY和NE浓度明显低于对照组。4.AML患者骨髓组织中Th细胞相关分子的表达异常4.1 IHC检测Th细胞相关分子Foxp3和IL-17的蛋白水平表达为了探讨骨髓微环境中的免疫状态,我们采用IHC技术检测了 40例AML患者和20例正常对照的骨髓活检组织中Foxp3和IL-17的表达。AML患者骨髓组织中Foxp3的高表达率高于对照组,但是无统计学差异。至于IL-17,我们发现在AML和对照组均呈高表达。尽管Foxp3在AML组的SI高于对照组的SI,但差异无统计学意义。IL-17的SI在AML组和对照组无统计学差异。我们又进一步在AML患者和对照组进行了 Foxp3/IL-17的分析,但差异无统计学意义。4.2实时定量RT-PCR检测Th细胞相关分子Foxp3和IL-17 mRNA的表达水平我们应用实时定量RT-PCR方法检测了40例AML患者和20例正常对照的Foxp3和IL-17的mRNA表达水平。虽然Foxp3的mRNA表达水平在AML患者较对照组是升高的,然而两者之间无统计学差异,这个结果与IHC数据一致。而IL-17,结果显示与对照组相比AML患者mRNA表达水平显著降低。我们也分析了AML患者和对照组Foxp3/IL-17,与对照组相比,Foxp3/IL-17的比例在AML组显著增加,差异有统计学意义。5.AML患者骨髓神经相关分子与Th细胞相关分子之间的相关性为了探讨神经相关分子与Th细胞相关分子之间的关系,我们统计了 40例AML患者nestin、TH、S100B和GFAP的mRNA表达水平以及Foxp3和IL-17的mRNA表达水平,分析这些因子表达的相关性。结果显示,在AML患者的骨髓中,nestin与TH和IL-17呈正相关,TH与IL-17之间亦呈正相关。重要的是,我们发现nestin及TH与Foxp3/IL-17呈显著负相关。6.AML患者骨髓神经相关分子与Th细胞相关分子与临床特征的相关性我们将60例AML患者骨髓活检组织中nestin、TH、S100B和Foxp3的表达水平与性别、年龄、FAB亚型和染色体核型分组等临床特征进行了相关性研究,结果显示这些分子的表达与AML的临床特征并无显著相关性。7.AML患者神经相关分子和Th细胞相关分子表达与临床预后的相关性为研究骨髓神经相关分子和Th细胞相关分子与AML患者预后的相关性,我们随后随访了 60例AML患者,中位OS为15.5个月(范围,2-34个月)。AML患者的Kaplan-Meier生存曲线显示高表达nestin和高表达S100B的AML患者有更长的生存期。Cox比例风险回归分析发现年龄、性别、TH和IL-17的表达对生存率没有影响,而nestin和S100B可能是独立预后因素。结论:1.AML患者的骨髓微环境存在交感神经病变,而且与AML患者的预后相关。2.AML患者的骨髓交感神经病变可能会引起神经递质浓度降低,导致Th细胞免疫功能失衡。第二部分AML患者骨髓间充质干细胞诱导分化为类神经细胞的研究研究背景:骨髓来源的间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)是一种多能干细胞,可以诱导分化成为多种成熟间充质细胞。BM-MSCs作为一种非造血干细胞,其表面缺乏造血干细胞(haemopoietic stem cells,HSCs)的免疫学标记,是骨髓造血微环境(hematopoietic mieroenvironment,HM)的重要组成部分,是多种造血龛构成细胞的前体细胞。BM-MSCs既能直接通过与HSCs之间的多种细胞粘附分子及信号传导来调控骨髓造血,也能通过分化为成熟的间充质细胞对骨髓中的HSCs提供机械支持作用和分泌多种细胞因子来促进HSCs的分化。BM-MSCs不仅对维持正常骨髓造血具有重要作用,由于其具有双向免疫调节、多向分化和归巢肿瘤的特性,在血液恶性肿瘤的发生发展中也具有重要意义。有研究发现BM-MSCs在体外能够抑制白血病细胞和淋巴瘤细胞的增殖,在体内能够改善同种异体移植后宿主的排斥作用,利于骨髓造血的重建。然而亦有研究发现BM-MSCs会促进肿瘤生长和产生耐药。BM-MSCs和白血病细胞的作用具有双向性,BM-MSCs的生物学特性和细胞功能在有些血液恶性疾病中也会出现改变。研究发现AML患者的BM-MSCs比正常志愿者的BM-MSCs具有更强的免疫抑制和抗炎作用;再生障碍性贫血(aplasticanemia,AA)患者的BM-MSCs不仅增殖能力减弱,而且向脂肪分化增加,成骨细胞分化减少。白血病细胞和BM-MSCs之间的相互作用机制尚不明确,有猜测认为白血病细胞会促使BM-MSCs的基因和遗传学性状发生改变,形成一种有利于白血病细胞生存的造血龛。虽然这种猜测尚未得到完全证实,但有研究发现有些血液恶性肿瘤的BM-MSCs会有基因表达谱的改变,基因表型的变化,细胞功能的异常。进一步的研究发现,AML细胞可能通过影响BM-MSCs的转录造成了基因表型的变化。除了BM-MSCs在基因及分子水平的改变,还有研究发现AML患者骨髓来源的BM-MSCs成骨分化和成脂分化的能力也会有变化,但研究结果不尽相同。我们前期研究发现,骨髓中的神经组织在骨髓正常造血中发挥重要作用,骨髓神经病变及细胞免疫改变在AML的发生发展中具有重要作用。BM-MSCs具有多种亚群,可能来源于不同的胚层。其中来源于神经嵴的间充质干细胞阳性表达nestin,是构成造血龛和调控HSCs的主要细胞。这些nestin阳性的基质干细胞和交感神经及Schwann细胞共同来源于神经嵴,并且nestin阳性的基质干细胞可能包含Schwann细胞的前体细胞。正常的BM-MSCs具有向神经细胞分化的潜能,AML患者的BM-MSCs是否有生物学特征的异常,其向神经细胞分化的能力是否发生了改变,需要进一步深入的研究。研究目的:探讨AML患者BM-MSCs的生物学特征和向神经细胞分化能力的变化,通过与对照组的比较研究,探讨BM-MSCs在AML发生发展中的作用。研究方法:1.分组:AML患者组为新诊断AML患者30例,对照组为肿瘤学及炎症免疫学方面无异常的缺铁性贫血患者18例。2.分离和培养BM-MSCs:通过Ficoll密度梯度离心和贴壁培养的方法,获取AML患者和对照组骨髓组织中的贴壁细胞。通过CCK8细胞增殖实验检测两组细胞的增殖能力。3.BM-MSCs的鉴定:根据干细胞鉴定标准来鉴定获得贴壁细胞,显微镜下观察细胞形态;应用流式细胞技术检测细胞的表面抗原表达;通过干细胞的成脂分化实验,鉴定贴壁细胞的分化能力;4.BM-MSCs分化为类神经细胞的诱导方案的筛选:利用三种诱导方案(BME+BHA,IBMX,EGF+bFGF)将BM-MSCs诱导分化为类神经细胞,检测其诱导效率,筛选相对高效的诱导方案;5.应用筛选好的诱导方案,诱导AML组和对照组的BM-MSCs分化为类神经细胞,通过镜下计数类神经细胞的数目,比较两组细胞的诱导率;应用免疫荧光技术检测诱导后细胞的神经相关分子的表达。研究结果:1.从AML患者的骨髓组织中成功获取BM-MSCs:培养早期AML来源的BM-MSCs的增殖能力强于对照组,传代培养后,差异渐不明显。两组细胞形态无明显差异。2.IBMX诱导方案效率最高:通过比较BME+BHA,IBMX,EGF+bFGF的诱导效率,发现以IBMX为诱导剂的诱导方案,诱导时间短,诱导率较高(P=0.039),后续实验选择IBMX方案进行诱导。3.AML患者来源的BM-MSCs可以诱导分化为类神经细胞:AML患者来源的BM-MSCs和对照组的细胞类似,经IBMX诱导分化后,均有部分细胞分化为类神经细胞;免疫荧光检测神经相关分子的表达,发现两组细胞都有nestin表达下降,tubulin和GFAP表达升高;但是AML患者的BM-MSCs向神经细胞的诱导分化率降低(P=0.001)。结论:1.AML患者的骨髓组织中可以成功获取BM-MSCs。2.AML患者来源的BM-MSCs与对照组相比,没有形态和增殖能力的变化。3.AML患者来源的BM-MSCs向神经细胞分化的能力降低。