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杆状病毒在自然环境中只感染节肢动物,它具有双链、环状超螺旋结构的基因组。包含在β-杆状病毒属中的小菜蛾颗粒体病毒(Plutella xylostella granulovirus,PlxyGV),它的宿主小菜蛾是十字花科害虫之一,小菜蛾颗粒体病毒是一种应用远景可观的生物杀虫剂。可是在β-杆状病毒感染相应细胞系后却始终无法获得高浓度的BV(budded virus),说明这些细胞系并不是p-杆状病毒最合适的受纳细胞系,这些离体培养系统还不成熟。通过本实验室已有的研究发现,在Sf9细胞中PlxyGV的晚期基因表达受阻,晚期基因表达受阻可能是其感染相应细胞系后无法实现离体培养的原因之一。而只有在早期基因表达和病毒DNA复制之后,晚期基因才能表达。本研究在已构建的小菜蛾颗粒体病毒bacmid和荧光报告系统的基础上,进一步对小菜蛾颗粒体病毒的早期基因启动子在非受纳细胞系Sf9中的表达活性进行研究。通过对其早期基因表达情况的研究,分析其制约晚期基因表达的原因,并尝试分析制约病毒离体复制的原因。(1)通过基因克隆,构建了由PlxyGV的早期或极早期启动子(pxP 17,pxPorf93,pxPorf78,pxPorf61,pxPie 1)以及与之同源的AcMNPV(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)的早期或极早期启动子(acP29,acPorf65,acPorf90,acPorf25,acPie 1)分别控制报告基因 luciferase 的 10个报告质粒。(2)利用Bac-to-Bac系统将由PlxyGV以及AcMNPV的早期或极早期启动子控制luc基因的报告质粒分别转座到Plxy GV bacmid和vAcgp64KO上构成相应的重组报告Bacmid(vPxpxP17-luc vPxpxPor178-luc vPxpxPorf6f7luc vPxpxPorf93-luc vPxpxPiel-lucvAcaor29-luc vAcacPorf90-luc yAcacPorf25-luc yAcacPorf65-luc vAcacPiel-luc vAc pxP17-luc vAcpxPorf78-luc vAcpxPorf6l-luc vAcpxPorf93-luc vAcpxPiel-lucyPXacP29-luc yPXacPorf90-luc yPXacPorf25-luc yPXacPorf65-luc yPXacPiel-luc)。(3)通过转染Sf9细胞和荧光素酶活性的实时表达分析,发现在PlxyGV的非受纳细胞系Sf9中,所有插入到敲除了 gp64的AcMNPV基因组中的PlxyGV以及AcMNPV的早期和极早期启动子都能够被激活并驱使报告基因luc表达,luc水平随时间点的累积变化图式相似,但用vAcpx-1uc转染的细胞在各个时间点测得的luc水平相比于vAcac-luc均相对较低。然而,除极早期启动子iel控制luc的报告质粒转座到PlxyGV bacmid中,luc水平随时间点有明显变化以外,其余四个Px早期基因启动子及与之同源的Ac早期启动子控制luc的报告质粒转座到PlxyGV bacmid中,luc水平随时间点无明显变化,均与mock值相当。结果表明:PlxyGV早期基因的启动子控制的报告基因luciferase构成的报告质粒,插入到PlxyGV基因组中构成的重组报告Bacmid,不能在被转染的Sf9细胞中有效表达,而插入到敲除了gp64的AcMNPV bacmid中构成的重组报告Bacmid却能高效表达。AcMNPV bacmid中存在某种拯救PlxyGV的早期基因表达的机制。而PlxyGV iel基因的启动子插入到PlxyGV基因组能在被转染的Sf9细胞中有效表达,可能是因为要使极早期基因被激活并使之表达仅依赖宿主细胞的因子,这表明Sf9的细胞因子中存在iel基因转录所需要的某种因子。(4)将实验室之前成功构建的五个由PlxyGV的晚期和极晚期基因启动子控制luc基因的报告质粒分别转座到PlxyGV bacmid和vAcgp64KO上构成的相应重组报告Bacmid(vAcpxPe25-luc,vPxpxPe25-luc,vAcpxPvp39-luc vPxpxPvp39-luc vAcpxPgp41-luc,vPxpxPgp41-luc,vAcpxPoPorf21-luc,vPxPxorP21-luc vAcpxPorf5O-luc,vPxpxPorf50-luc)通过转染Sf9细胞和荧光素酶活性的实时表达分析,发现在PlxyGV的非受纳细胞系Sf9中,五个Px晚期基因启动子控制luc的报告质粒转座到vAcgp64KO中,再转染Sf9细胞后,luc水平随时间点均有明显变化,在转染后48h,达到最高值,之后开始下降,最高值约为107;然而,五个Px晚期和极晚期基因启动子控制luc的报告质粒转座到PlxyGV bacmid中,luc水平随时间点均无明显变化,均与mock值相当。结果表明:PlxyGV的晚期或极晚期基因的启动子控制的报告基因luciferase构成的报告质粒,插入到PlxyGV基因组中构成的重组报告Bacmid,不能在被转染的Sf9细胞中有效表达,而插入到敲除了gp64的AcMNPV bacmid中构成的重组报告Bacmid却能高效表达。AcMNPV bacmid中存在某种拯救PlxyGV的晚期或极晚期基因表达的机制。(5)实验室之前通过λ-red同源重组系统从野生型AcMNPV基因组中分别敲除了iel,lef8,gp64基因构成了三种基因缺失的重组bacmid vAcielKO,vAclef8KO,vAcgp641O。选取vPxpxPorf78-lue(lef4)作为代表分别与vAcie1KO,vAclef8KO,vAcgp64KO 共转染Sf9细胞,分别在转染后24h及36h测定荧光素酶活性值。用vPxpxPorf78-luc单独转染作为对照,通过荧光素酶活性的瞬时表达分析,研究AcMNPV的不同重组体对PlxyGV早期基因表达的拯救作用。结果表明:在报告Bacmid vPxpxorf78-luc与vAcielKO共转染的细胞中荧光素酶活性与vPxpxPort78-luc单独转染细胞的荧光素酶活性相当,而vPxpxPorf78-luc与vAclef8KO以及与vAcgp64KO共转染的细胞中均可检测到高水平的荧光素酶活性。在PlxyGV的非受纳细胞系Sf9中,PlxyGV的早期基因在vAcgp64KO和vAclef8KO存在的情况下都可得到一定程度的拯救,而vAcielKO对于PlxyGV的早期基因表达并无明显的拯救作用,即AcMNfPV的lef8,gp64基因对于PlxyGV早期基因表达的拯救并不发挥决定性作用,而iel对于PlxyGV早期基因表达的拯救起决定性作用。(6)用几乎包含了AcMNPV全部基因的五个cosmid(cos#l,cos#10,cos#51,cos#58,cos#59),分别与vPxpxPorf78-luc(lef4)共转染Sf9细胞,用vPxpxPorf78-luc单独转染作为对照,转染后36h测定荧光素酶活性(luc)值。结果表明:仅cos#58对PlxyGV早期基因的表达有明显的拯救作用。而AcMNPV的ie1基因包含在cosmid#58之中,因此AcMNPV的ie1基因可能在对cosmid#58对PlxyGV早期基因表达的拯救作用中起了关键性作用。