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本试验主要部分之一是从mRNA,蛋白质和蛋白因子分泌水平探讨胚胎神经干细胞/祖细胞(NSCs/NPCs)在体外分化过程中一些相关基因的分子表达机制,其中试图着重探讨音猥蛋白因子(Shh)和成纤维细胞生长因子8(FGF8)这两组信号通路在胚胎神经干细胞/祖细胞分化过程中的重要作用。
主要部分试验内容之一是探讨鼠胚胎神经干细胞或祖细胞(NSCs/NPCs)在体外分化过程中Shh和FGF8信号通路相关因子的动态表达变化和向胞外分泌的状况。我们应用的主要技术方法有:荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、细胞免疫荧光、ELISA和流式细胞术等等。首先,我们主要从mRNA的转录水平,蛋白的翻译水平,蛋白的外分泌水平这3个方面或3个分组来分别探讨FGF8及Shh信号通路在NSCs/NPCs分化过程中的重要参与、表达变化和探寻其可能的角色等等。我们的研究发现,在胚胎神经干细胞或祖细胞的体外分化过程中,伴随着FGF8和Shh这两个信号通路相关成员因子群的动态差异表达变化;同时这两个信号通路分别的配体和受体的动态表达变化曲线却均不一定同步。FGF8蛋白因子和Shh蛋白因子均可以持续不断的分泌到神经细胞的外微环境(niche)中,它们的动态分泌变化曲线亦不同步。
我们对FGF8的干涉试验证实,当成纤维细胞生长因子8因子浓度下降或受干扰时,神经干细胞/神经前体细胞在体外的分化进程明显受阻。相对的,在添加FGF8人工合成蛋白因子到NSCs/NPCs体外分化培养基的干预试验中,当成纤维细胞生长因子8活性蛋白因子含量在一定量的情况下,会促进神经干细胞/祖细胞向多巴胺能神经元分化比例的增加,检测结果显示此时NSCs/NPCs体外分化结果(分化20天后)的几种神经细胞类型产物比对照组有显著的提高或差异。但添加物人工FGF8重组蛋白对分化及未分化的神经细胞的毒性却是很低的,甚至反而提高了此过程中的神经细胞的抵抗能力等等。我们的试验亦充分证明了FGF8及Shh信号通路对NSGs/NPCs分化过程的积极参与和重要影响。FGF8等信号通路会对NSCs/NPCs的分化方向、分化结果等影响至深。
为探讨成纤维细胞生长因子8在成年鼠大脑内的细胞分布、定位情况,以及在神经干细胞/祖细胞体外分化过程中在神经细胞内的定位情况,我们采用免疫组织化学、细胞免疫荧光、流式细胞术等技术对此些方面进行了检测、分析。从实验结果得出,成纤维细胞生长因子8蛋白成份在成年大鼠大脑内有广泛的分布和表达,特别是在中脑黑质部位有明显的阳性分布呈现。但有的部位的表达结果稍有不同,例如在尾壳核和纹状体的表达为阴性,在大脑后扣带回则为可疑表达。我们发现在胚胎神经干细胞/祖细胞的体外分化过程中,成纤维细胞生长因子8(FGF8)及它的潜在受体之一成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)均可以亚定位于神经细胞的细胞膜和细胞质内。我们分析推导认为FGF8及其受体FGFR3的细胞内定位特征符合FGF8蛋白因子可以作为一个胞外分泌即可向细胞外排放的蛋白因子的特征存在的。这部分试验同样反映出了FGF8 signaling pathway在胚胎神经干细胞/祖细胞(NSCs/NPCs)体外分化及体内神经发育和神经活动过程中的广泛参与并发挥了重要的作用。
神经干细胞(NSC)的发现和NSC分离培养技术的成熟,为人类研究神经生物学提供了方便、廉价的操作平台;也为人类采用细胞移植技术治疗诸如Parkinsonfs Disease,Alzheimers Disease等退行性神经疾病提供了另一条途径。