益生元对凡纳滨对虾抗病性能影响及Toll样受体基因多态性影响研究

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:andrea815
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凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国重要的经济虾类。但是随着养殖强度不断增加以及养殖环境的恶化,特别是疾病的爆发,导致养殖失败。因此迫切需要针对限制凡纳滨对虾产量降低的因素,全面了解对虾免疫系统调控机制,并期通过改善养殖环境、使用益生元、筛选和建立有效的抗病分子遗传标记达到改良凡纳滨对虾种质、降低发病率的目的。本文首先介绍凡纳滨对虾感染WSSV及V.alginolyticus后不同组织的Toll样受体基因表达变化研究;其次,采用SNPs标记技术对易感、抗WSSV、抗溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的三个试验群体的Toll1受体基因进行多态性分析,并进行了SNPs位点与抗病性状的关联分析;此外,探讨菊粉、甘露寡糖对凡纳滨对虾Toll样受体基因表达以及抗病性能的影响,进一步了解Toll样受体基因介导的免疫应答反应,并筛选到高效的饲料组合;本试验还对其他免疫相关基因进行了探讨,以期全面了解凡纳滨对虾的免疫机制,具体研究内容如下:(1)凡纳滨对虾感染WSSV及V.alginolyticus后不同组织的Toll样受体基因表达变化研究利用荧光定量PCR技术测定3种凡纳滨对虾Toll样受体基因在虾体感染不同病原微生物后不同组织中的表达量,同时比较了不同感染阶段中不同组织中3种Toll样受体基因的表达变化情况,其中,Toll1受体基因在肌肉、血淋巴、心脏和鳃均有较高表达,心脏表达量最高;Toll2受体基因在血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,其中在鳃表达量最高;Toll3受体基因在鳃和心脏有较高表达,其中在鳃表达量最高。感染WSSV后凡纳滨对虾血液及鳃中3种Toll样受体基因表达量均显著提高(P<0.05),并在各自达到表达峰值后逐渐下降直至恢复到感染前水平;感染V.alginolyticus后凡纳滨对虾血淋巴中3种Toll样受体基因表达量均显著提高(P<0.05),鳃中Toll1及Toll3表达量分别于感染后3小时和12小时有显著提高(P<0.05);长期感染WSSV或V.alginolyticus后,凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高。(2)凡纳滨对虾Toll1样受体基因SNPs与抗病性能的关联分析采用SNPs分子标记技术对本试验获得的易感、抗WSSV、抗V.alginolyticus三个试验群体的Toll1受体基因进行多态性分析,并进行SNPs位点与抗病性状的关联分析,分析表明位点c.1430C>T、c.1877C>T的基因型频率和等位基因频率分布在易感组和抗WSSV组间存在显著差异(P<0.05),两个位点的抗性优势等位基因分别为T、C,抗性优势基型分别为CT、CC;位点c.1877C>T基因型频率和等位基因频率分布在易感组和抗V.alginolyticus组间也存在显著差异(P<0.05),初步说明CC这种基因型可能与抗V.alginolyticus性状正相关。(3)菊粉(Inulin)、甘露寡糖(MOS)对凡纳滨对虾Toll样受体基因表达量以及抗病性能的影响分别投喂添加Inulin(2.5mg/g)、Inulin(5mg/g)、Inulin(10mg/g)、MOS(2.5mg/g)MOS(5mg/g)、MOS(10mg/g)、MOS(5mg/g)+Inulin(5mg/g)4周,结果显示Inulin(5mg/g)、Inulin(10mg/g)、MOS(5mg/g)、MOS(10mg/g)、MOS(5mg/g)+Inulin(5mg/g)5个饲料组均能显著提高相对增重率和特定生长率(P<0.05);喂养14天、28天时,Inulin(5mg/g)、Inulin(10mg/g)、MOS(5mg/g)、MOS(10mg/g)、Inulin(5mg/g)+MOS(5mg/g)5个饲料组的3种Toll样受体基因m RNA表达量显著提高;WSSV感染5天时,与对照组相比,Inulin(5mg/g)、Inulin(10mg/g)、MOS(5mg/g)、MOS(10mg/g)、Inulin(5mg/g)+MOS(5mg/g)5个饲料组的Toll样受体基因m RNA表达量显著升高(P<0.05);V.alginolyticus攻毒10天时,与对照组相比,Inulin(5mg/g)、Inulin(10mg/g)、MOS(5mg/g)、MOS(10mg/g)、Inulin(5mg/g)+MOS(5mg/g)5个饲料组Toll样受体基因m RNA表达量显著提高,得到饲料效果最好的是Inulin(5mg/g)+MOS(5mg/g)组合饲料组。(4)菊粉、甘露寡糖对4个凡纳滨对虾免疫相关基因表达量的影响为了全面了解凡纳滨对虾的免疫机制,通过喂养试验得到,Inulin(5mg/g)、Inulin(10mg/g)、MOS(5mg/g)、MOS(10mg/g)、MOS(5mg/g)+Inulin(5mg/g)5个饲料组的STAT、pro PO、Crustin、ERK基因m RNA表达量均显著高于对照组(P<0.05);当机体分别受到WSSV、V.alginolyticus感染后,Inulin(5mg/g)+MOS(5mg/g)、MOS(5mg/g)、Inulin(5mg/g)三组的pro PO、Crustin基因m RNA表达量均较对照组显著升高(P<0.05),STAT、ERK基因相对于对照组变化不明显,同时得到饲料效果最好的是Inulin(5mg/g)+MOS(5mg/g)组合饲料组。
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