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研究背景应用口腔种植修复已成为临床治疗牙列缺损、缺失最热门的方法。但在口腔种植修复中常遇到患者颌骨骨量不足,需要进行骨增量手术。同时,种植体与颌骨发生骨结合的时间也较长。因此,诱导内源性促成骨生长因子加速颌骨成骨过程,在短时间内促进颌骨新骨形成、缩短骨结合时间已成为口腔种植领域的一个研究热点,Mundy等发现辛伐他汀正具有该种效应。但辛伐他汀的骨生物利用度极低,且大量使用时存在潜在的副作用,从而严重限制了其在颌骨成骨领域的应用。本课题组前期通过应用纳米胶束包载辛伐他汀改造其剂型后,显著提高了辛伐他汀的体内、外成骨生物学效能,但既往的对纳米剂型辛伐他汀药代动力学非直接的定性观察或半定量研究有一定局限性。本研究利用高效液相色谱的高效能分离手段及其高精度、高灵敏度特性直接对细胞内药物进行定量研究,分析其细胞层面的药代动力学特性,并进一步在分子水平研究此剂型对成骨相关信号通路的影响,还通过体内实验证实其是否具有更强促成骨效能。研究目的1.从大体层面,对新生骨的三维结构进行定量分析,进一步证实载辛伐他汀纳米胶束较单纯辛伐他汀具有更强的促成骨效能。2.从细胞层面,对载辛伐他汀纳米胶束和单纯辛伐他汀在细胞摄取方面的差异进行评价,弥补既往无直接定量研究的不足,更有利于分析载辛伐他汀纳米胶束更强促成骨效能的可能机制。3.从分子层面,对载辛伐他汀纳米胶束和单纯辛伐他汀对成骨相关信号通路调控的差异进行评价,进而探讨载辛伐他汀纳米胶束具有更强促成骨效能的可能机制。研究内容第一部分:载辛伐他汀纳米胶束体内促成骨效能的三维定量评价1.在课题组前期对体内骨缺损修复区域新生骨二维结构进行定性和半定量分析的基础上,应用microCT扫描获取新生骨数据并对其三维重建,对新生骨的骨矿物质密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）进行三维定量分析,进一步证实载辛伐他汀纳米胶束的体内促成骨效应。第二部分:MG63细胞对载辛伐他汀纳米胶束和单纯辛伐他汀摄取的差异性评价1.利用高效液相色谱法的高效能分离手段及其高精度、高灵敏度特性定量分析细胞对单纯辛伐他汀的与载辛伐他汀纳米胶束的药物动力学差异。第三部分:载辛伐他汀纳米胶束和单纯辛伐他汀通过ERK1/2通路对MG63细胞成骨分化调节的差异性评价1.评价不同加药浓度对MG63细胞增殖活性和碱性磷酸酶活性的影响,筛选合适的加药浓度。2.通过对各实验组ERK1/2磷酸化蛋白表达量的检测,评价载辛伐他汀纳米胶束和单纯辛伐他汀对ERK1/2通路调控的差异。3.应用抑制剂PD98059有效抑制ERK1/2通路后,评价载辛伐他汀纳米胶束和单纯辛伐他汀通过ERK1/2通路对MG63细胞增殖活性、细胞周期、细胞凋亡及成骨分化调节的差异。研究结果1.MicroCT检测结果提示,加药4周时,较单纯辛伐他汀,载辛伐他汀纳米胶束可显著促进兔颅骨缺损区域新生骨的密度、体积和骨小梁数目,表现出更强的体内促成骨效能。2.细胞对单纯辛伐他汀的摄取十分迅速,15min时其胞内浓度即达到最高峰,但60min后开始缓慢下降。同时,胞外药物梯度浓度与单纯辛伐他汀的细胞摄取量呈线性关系,且胞外温度的降低对其细胞摄取量无影响。以上均提示单纯辛伐他汀可通过被动扩散被细胞摄取。3.细胞对载辛伐他汀纳米胶束的摄取前30min显著低于单纯辛伐他汀,此后缓慢上升,60min后其胞内药物浓度开始超越单纯辛伐他汀,这种优势在240min时仍存在。同时,胞外药物梯度浓度与载辛伐他纳米胶束的摄取量呈非线性关系,且降低温度可使其摄取量显著降低约35%。以上均提示载辛伐他汀纳米胶束可通过胞吞被细胞摄取。4.当加药浓度为0.25μmol/L时,载辛伐他汀纳米胶束较单纯辛伐他汀可显著抑制MG63细胞的增殖活性,同时显著提高其ALP活性,选择该浓度用于后续实验较适合。5.在加药干预早期,载辛伐他汀纳米胶束较单纯辛伐他汀,可显著提高MG63细胞的ERK1/2通路的激活强度,且在15min时达到顶峰。随着药物干预时间的延长,24h时,两者对ERK1/2通路的作用均转为显著抑制,这种抑制作用在加药后14d时仍存在,同时,载辛伐他汀纳米胶束对ERK1/2通路的抑制作用更强。6.加入抑制剂PD98059有效抑制ERK1/2通路的激活后,各实验组中MG63细胞的增殖活性均显著下降,而所处G0/G1的比例和凋亡比例均显著上升。同时,各实验组中MG63细胞的成骨细胞特异性转录因子OSX的表达均显著提高,细胞的ALP活性和OC蛋白表达也有显著提高。以上均提示,载辛伐他汀纳米胶束可通过对ERK1/2通路更强的抑制作用,进而在显著抑制细胞增殖的同时,显著提高辛伐他汀促成骨效能。研究结论1.载辛伐他汀纳米胶束的确可显著提高单纯辛伐他汀的体内促成骨效能。2.载辛伐他汀纳米胶束可通过胞吞被细胞摄取,并可有效提高辛伐他汀在胞内的浓度和作用时间,在相同加药浓度的情况下,显著提高单纯辛伐他汀的促成骨效能。3.ERK1/2通路在MG63细胞成骨分化中起负调控作用,载辛伐他纳米胶束和单纯辛伐他汀对ERK1/2通路的调控均主要表现为抑制作用。并且,载辛伐他汀纳米胶束可通过更强的抑制ERK1/2通路的激活,显著提高辛伐他汀的促成骨效能。4.由于以上特性,载辛伐他汀纳米胶束有助于提高药物效能,临床应用其促进颌骨成骨时,不仅可局部给药,还可减少用药剂量,避免全身、高剂量服用辛伐他汀带来的毒副作用。