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研究背景和目的：吸烟是引发慢性阻塞性肺部疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases, COPD)的主要危险因素。香烟含有大量的氧化物质,这些氧化物能激活蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2(protein tyrosine phosphatase, Shp2)。Shp2是一种由PTPNII基因编码的蛋白酪氨酸磷酸酶,含有2个SH结构域,其作为细胞因子、生长因子及其他胞外刺激因素的下游信号分子广泛地表达于机体各种组织和细胞中,参与细胞增殖、分化、死亡等诸多细胞生命活动环节。我们之前研究证明吸烟和香烟烟雾提取物(Cigarette smoke extract,CSE)能够激活人上皮细胞Shp2mRNA和蛋白的表达,Shp2抑制剂干预和肺上皮细胞Shp2基因敲除小鼠或细胞可减轻吸烟诱导的肺部炎症反应与上皮细胞炎症因子表达。本课题中我们探讨抑制和基因敲除Shp2减轻吸烟诱导小鼠肺纤维化的作用及机制。方法：1、整体实验：观察Shp2特异性抑制剂PHPS1干预和肺上皮细胞Shp2基因敲除小鼠对吸烟引起的肺纤维化指标的影响。小鼠每天吸烟10支,连续10天,诱导肺纤维化模型,检测指标包括转录生长因子β1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproleinase-9, MMP-9)、钙结合蛋白(Calcium binding protein, S100A4),胶原纤维沉积以及Shp2表达。1)收集肺泡灌洗液(BALF),采用酶联免疫吸附(Elisa)法检测BALF上清中MMP-9和TGF-β1蛋白表达；2)收集肺组织,制备匀浆上清液,采用定量多聚合酶链反应(Q-PCR)法测定匀浆上清液中MMPs和TGF-β1基因的表达；3)制作肺组织切片,采用免疫组化染色法检测小气道周围Shp2、MMP-9和S100A4表达；4)肺组织切片,采用Masson胶原纤维染色法检测小气道周围胶原纤维沉积。2、离体实验：观察Shp2特异性抑制剂PHPS1处理肺上皮细胞和Shp2基因沉默肺上皮细胞对CSE诱导的MMP-9和TGF-β1表达的影响,以及对信号分子的影响。香烟烟雾提取物(CSE)刺激小鼠正常肺上皮细胞MLE-12：1)采用MTT法测定MLE-12细胞活性；2) Western blot (WB)法检测CSE诱导p-Shp2和Shp2表达；3)CSE刺激MLE-12细胞,Q-PCR法检测MMPs基因表达,WB法检测MMP-9蛋白表达；4)Shp2特异性抑制剂PHPS1干预细胞后进行CSE刺激,采用Q-PCR和WB法检测Shp2对CSE诱导MMP-9基因和蛋白的影响；5)Shp2siRNA沉默Shp2基因后进行CSE刺激,采用WB法检测Shp2对CSE诱导MMP-9的调节作用。香烟烟雾提取物(CSE)刺激人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549：6)CSE刺激A549细胞,半定量多聚合酶链反应(RT-PCR)和Elisa法检测TGF-β1基因和蛋白表达；7)Shp2特异性抑制剂PHPS1干预A549细胞后进行CSE刺激,采用Q-PCR法检测Shp2对CSE诱导TGF-β1基因表达的影响；8)作用机制研究：预先给予Erk1/2抑制剂U0126, JNK抑制剂SP600125,p38抑制剂SB203580阻断Erk1/2, JNK和p38的活性,CSE刺激MLE-12细胞后,Q-PCR和WB法检测CSE诱导MMP-9表达,研究分析其可能的作用机制。结果：1、整体实验：1)小鼠经香烟烟雾暴露10天后,肺泡与小气道上皮细胞的Shp2表达显著增高；2) BALF上清中MMP-9及TGF-β1的蛋白表达显著性增强；肺组织中MMP-9和TGF-β1基因水平表达明显升高；肺组织MMP-9、S100A4的表达量以及胶原纤维沉积明显升高；3)与对照组小鼠相比,烟雾暴露小鼠经Shp2特异性抑制剂PHPS1干预后,BALF上清中MMP-9、TGF-β1的蛋白表达显著性下降；肺组织匀浆MMP-9和TGF-β1的基因表达水平亦明显降低,肺MMP-9、S100A4表达量以及胶原纤维沉积明显减少；4)肺上皮细胞Shp2基因敲除小鼠与对照组小鼠相比,BALF上清中MMP-9和TGF-β1蛋白释放显著性下降,肺组织匀浆中MMP-9和TGF-β1的基因水平表达明显降低,肺MMP-9、 S100A4的表达量以及胶原纤维沉积同样明显减少。2、离体实验：1)细胞活力检测中,不同浓度的CSE(0.5%～5%)与肺上皮细胞MLE-12分别培养24、48、72h,呈浓度和时间依赖引起MLE-12细胞损伤,细胞的存活率下降；2)CSE呈浓度依赖诱导MLE-12细胞Shp2基因和蛋白表达以及诱导Shp2磷酸化表达；3)CSE呈浓度和时间依赖诱导MLE-12细胞表达MMP-9基因和蛋白；4)Shp2特异性抑制剂PHPS1抑制CSE诱导的MLE-12细胞表达MMP-9基因和蛋白；5)MLE-12细胞Shp2基因沉默后能显著减少CSE诱导表达MMP-9蛋白；6)CSE刺激人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549,呈浓度和时间依赖诱导A549细胞表达TGF-β1基因和蛋白；7)Shp2特异性抑制剂PHPS1抑制CSE诱导A549细胞表达TGF-β1基因；8)CSE可诱导MLE-12细胞JNK和p38信号蛋白的磷酸化,对Erkl/2和Akt信号蛋白磷酸化无明显影响。JNK抑制剂SP600125能显著抑制CSE诱导的肺上皮细胞MMP-9释放,PHPS1能显著降低由CSE诱导的肺上皮细胞JNK磷酸化。结论：1)Shp2特异性抑制剂PHPS1干预小鼠或将小鼠肺上皮细胞Shp2基因敲除均可显著减轻吸烟引起的肺纤维化；2)Shp2特异性抑制剂PHPS1干预肺上皮细胞或将肺上皮细胞Shp2基因沉默均可显著减少CSE诱导的MMP-9和TGF-β1表达。3) Shp2/JNK信号通路可能是吸烟诱导小鼠肺纤维化的信号转导机制。本研究结果提示Shp2是香烟烟雾引发肺纤维化可能的潜在靶点。