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近年来猪肉品质受到消费者和生产者的广泛重视,生产优质高档猪肉已经成为生产者追求的目标,其中肌内脂肪含量与抗氧化性能是衡量猪肉品质的重要指标。目前影响肌内脂肪含量与抗氧化性能的主效基因正被广泛研究,以期获得优良目的性状。前期实验室成功构建PID1、CuZnSOD真核表达载体,通过精子载体法获得的转基因兔经性能测定肌内脂肪含量与肉质抗氧化性能分别显著提高。同样日常屠宰后肌内脂肪含量高的猪肉极易发生氧化,影响了猪肉品质,而提高猪肉抗氧化性能正好解决此问题,目前研究也着力于对PID1与CuZnSOD基因的单独研究。本研究构建PID1与CuZnSOD基因共表达载体,不仅提高了转基因效率,同时表达两种内源基因,而且在获得高肌内脂肪含量猪肉品质的同时,提高了猪肉的抗氧化性能,为进一步制备肌内脂肪显著提高并兼备高抗氧化性能的转基因猪等育种新材料奠定基础。本研究主要获得了如下结果: 一、设计特异性引物,扩增PID1基因与CuZnSOD基因编码区,PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化,用BglⅡ/EcoRⅠ双酶切CuZnSOD,并同时酶切空载体pIRES2-acGFP1,对酶切产物进行回收纯化后用T4连接酶连接。将连接产物转化到大肠杆菌里,用卡那抗性的培养平板均匀涂板,过夜培养进行抗性筛选。阳性克隆经酶切与测序鉴定得到质粒pIRES2-CuZnSOD。P1/P2扩增PID1产物将经SalⅠ/HindⅢ双酶切后,亚克隆入质粒PUC57-2A,克隆转化得到质粒PUC57-2A-PID1。质粒PUC57-2A-PID1经EcoRⅠ/SacⅡ双酶切,回收片段2A-PID1,克隆入质粒pIRES2-CuZnSOD中,转化后得到pIRES2-CuZnSOD-PID1载体。 二、将构建成功的重组质粒与脂质体X-tremeGENE HP DNA孵育转染PK15细胞。荧光显微镜下观察在细胞内的表达,可见转染后的细胞有绿色荧光出现。RT-PCR检测结果显示,转染细胞中PID1基因与CuZnSOD基因表达量明显高于对照组(P<0.05)。Western blot检测结果表明pIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体稳定有效表达。成功构建pIRES2-CuZnSOD-P ID1真核共表达载体,且双基因在真核细胞独立稳定表达,为转基因猪等育种新材料的制备奠定基础。 本研究通过2A肽构建PID1与CuZnSOD内源双基因载体,并验证在PK15真核细胞中重组载体成功独立稳定表达,研究结果在细胞水平上证实内源双基因共表达,为同时表达PID1与CuZnSOD基因,改善肉质性状提供方法支持,为进一步制备肌内脂肪显著提高并兼备高抗氧化性能的转基因猪等育种新材料奠定分子基础。