产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)广泛存在于自然界和动物的肠道中,是一种重要的人兽共患传染病的病原体之一。该菌可产生多种外毒素,根据其中的四种主要外毒素α、β、ε以及ι可将产气荚膜梭菌分为五个型别,分别是A、B、C、D和E型。在四种主要的外毒素中,由B和D型产气荚膜梭菌产生的ε毒素是一种剧烈的致病因子,能够导致羔羊和犊牛的肠道致死性疾病以及绵羊和山羊等动物的坏死性肠炎或者肠毒血症。由于ε毒素所导致动物的以上疾病具有发病急、死亡快及病程短等特点,使抗生素的治疗没有显著的意义,给世界各地的畜牧业造成巨大的经济损失。预防动物坏死性肠炎和肠毒血症最有效的方法是注射疫苗,和传统的ε毒素的脱毒疫苗相比,重组ε毒素的减毒疫苗的研究正在成为热点。本研究首先通过结构变化和定点突变的方法筛选减毒或无毒的ETX突变体蛋白,具体方法是以本实验室留存的分别带有pET-His-etx和pTIG-etx载体的菌株为基础,根据QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit操作说明书设计多对定点突变引物,通过PCR扩增技术分别对两个载体进行多位点的定点突变,将PCR产物用DpnI酶(可专一消化带有甲基化的DNA)消化后进行测序验证,将测序无误的载体转化到到大肠杆菌感受态细胞Escherichia coli BL21(DE3)pLysS中。挑取单克隆菌落于5 m L的LB培养基中扩大培养,将扩增后的菌液保存在冰箱,同时进行测序鉴定,鉴定正确的菌体按照1:100的比例转接到500 mL LB培养基中,在37℃培养箱中培养至A600值0.6-0.8时加入IPTG诱导剂,使其终浓度为1 mM,然后置于16℃的摇床中过夜诱导。将诱导后的菌液8000 r/min离心15 min后去上清,沉淀用PBS重悬后再次离心去上清,沉淀用100 mL蛋白纯化A液重悬后,超声破碎菌体。破碎的悬液在8000 r/min的转速下离心15 min收集上清,随后上清用0.45μm孔径大小的滤膜过滤后备用,用NaOH溶液清洗纯化仪,然后使蛋白纯化A液进入纯化仪,紧接着进过滤后的上清,再进一次蛋白纯化A液后进蛋白纯化B液,使用Ni2+柱对诱导后的蛋白进行纯化,SDS-PAGE实验对纯化后的蛋白纯度鉴定,western-blot实验对蛋白的抗原性进行鉴定。将超滤浓缩后的各突变体蛋白进行细胞毒性和动物毒力实验,分别用MTS法和改良寇式法计算细胞的CT50和小鼠的LD50以此验证各突变体蛋白的减毒效果。将减毒效果比较明显的epsilon毒素各突变体蛋白进行后续系列实验,以此阐明突变体蛋白的减毒机制。首先选取对etx敏感的mdck细胞进行细胞结合实验,将不同浓度的各突变体蛋白和mdck细胞孵育后,用4%的多聚甲醛固定15min,用5%的bsa封闭后和anti-his单克隆抗体孵育,最后和hrp荧光基团标记的羊抗鼠igg孵育。分别用多功能读板仪和激光共聚焦显微镜对mdck细胞表面的各突变体蛋白进行检测。随后对突变体蛋白在mdck细胞上的七聚体形成能力进行检测,将突变体蛋白和mdck细胞孵育后高温裂解细胞,用裂解后的细胞液悬液进行western-blot实验。然后使用钙离子探针检测突变体蛋白的成孔能力,将钙离子探针和mdck细胞孵育后清洗干净,用含有cacl2的hbss缓冲液将突变体蛋白稀释到不同的浓度,将稀释好的缓冲液和mdck细胞孵育,并实时在多功能读板仪中连续读取荧光值,以荧光值的变化来反映突变体蛋白的成孔能力。最后采用圆二色谱实验对各突变体蛋白的二级结构进行检测,以pbs作为背景,测定蛋白在190-260nm处的紫外吸收。选取四种突变体蛋白中减毒幅度最大的retxy196e-c蛋白作为抗原进行小鼠的免疫实验。首先对抗原的免疫剂量和免疫途径进行优化,将balb/c小鼠随机分为7组,每组20只,设置三个抗原免疫剂量和两个免疫途径,7个实验组分别是5μg皮下免疫组,5μg腹腔免疫组,10μg皮下免疫组,10μg腹腔免疫组,15μg皮下免疫组,15μg腹腔免疫组和1个pbs免疫组。小鼠共免疫三次,每两天测量一次小鼠体重,每次免疫一周后尾静脉采血进行elisa检测小鼠血清抗体效价,在第三次免疫一周后取部分小鼠进行天然毒素的攻毒实验,蛋白免疫组的小鼠设置三个剂量,分别是100×ld50,500×ld50和1000×ld50天然毒素,而pbs免疫组的小鼠设置一个10×ld50天然毒素攻毒剂量。另一部分小鼠取脾脏和全血,小鼠的脾脏经过裂解破碎后对其中t淋巴细胞进行染色,用流式细胞仪检测小鼠t淋巴细胞中两种细胞因子il-4和ifn-γ的比例。小鼠的全血经离心后取上清和等体积的重组天然毒素retx在37℃孵育30min后加入到mdck细胞或腹腔注射到正常小鼠体内,观察免疫后小鼠血清的体外中和能力。为了验证由突变体蛋白retxy196e-c刺激小鼠免疫系统产生的抗体与天然毒素retx和retxy196e-c之间的亲和力差别,将两种蛋白包被在酶联板中,分别和小鼠的血清或单克隆抗体孵育,用不同浓度的nh4scn洗脱的方式进行亲和力指数的测定。通过本研究方法,成功构建和表达了四种etx突变体蛋白retx、retx-c、retxy196e以及retxy196e-c,并通过实验验证了c-末端和196位氨基酸突变都能减弱epsilon毒素的毒性且两种因素之间存在协同作用,其中c-末端主要通过影响epsilon毒素与靶细胞的结合继而影响了成孔和七聚体的形成来减弱epsilon毒素的毒性,而196位氨基酸突变只是微弱的影响了成孔和七聚体的形成。动物实验和活细胞实验结果显示,突变体蛋白rETX-C和rETXY196E的小鼠LD50值为110,000,rETX的小鼠LD50值为7910,而突变体蛋白rETXY196E-C的小鼠LD50值为1770,000。说明只突变Y196位氨基酸或只加入C-末端时,其对细胞和动物的毒性减弱幅度相似,Y196为氨基酸突变一定通过某种机制影响了epsilon毒素的毒性,但是具体是通过哪种机制还没有完全阐明。动物免疫实验结果显示,减毒幅度最大的突变体蛋白rETXY196E-C能够较好的刺激小鼠免疫系统,使其产生较多且同时具有体内体外中和活性的抗体。在6个实验组中,15μg皮下免疫组的小鼠80%能够抵抗1000×LD50天然毒素的攻击,皮下免疫组的小鼠能够抵抗500×LD50天然毒素的攻击,而腹腔免疫组的小鼠只能抵抗100×LD50天然毒素的攻击。病理实验结果显示,PBS免疫组的小鼠在经过1000×LD50天然毒素的攻击后,小鼠的脑部出现了大量的空泡状坏死,小鼠的肾出现了严重的出血坏死。而15μg剂量组皮下免疫方式的小鼠在遭受1000×LD50天然毒素的攻击后,其肾脏和脑部的病变坏死得到了明显的改善。以上结果表明,免疫后的小鼠能够明显减弱天然毒素对其敏感器官的损伤。说明皮下免疫方式优于腹腔免疫,15μg剂量优于其他两个剂量。抗原抗体亲和力实验结果显示,由蛋白rETXY196E-C刺激小鼠产生的抗体与rETX和rETXY196E-C之间的亲和力没有显著差别。因此,通过这种结构变化和定点突变的方式筛选epsilon毒素候选疫苗是可行的,同时重组蛋白rETXY196E-C具有较好的免疫原性和安全性,可作为ETX的候选疫苗研究,具有广阔的前景。