乌骨鸡（Black-bone silky fowl,BSF）又称乌鸡、泰和鸡等,是江西特有的药食两用资源。它集药、补、食三大功能于一体,对人体具有特殊的滋补功能,能够调节身体机能,提高人体免疫力。乌骨鸡黑色素是乌骨鸡最重要的功能成分之一,但由于溶解性差（不溶于水和有机溶剂）,化学结构还不清楚,导致目前乌骨鸡黑色素的测定还未有便捷、可靠的方法,因此寻找一种较简单、快速、准确且无需将黑色素完全溶解的新方法显得至关重要。本文成功地建立了一种测定乌骨鸡黑色素含量的H₂O₂氧化-荧光分析法方法,可用于快速、准确地分析乌骨鸡肉以及乌骨鸡黑色素细胞中黑色素的含量;乌骨鸡及其黑色素均具有良好的抗炎以及抗氧化效果,并且乌骨鸡黑色素是由黑色素细胞生成,乌骨鸡黑色素细胞在乌骨鸡体内广泛分布,本文通过低温超声裂解法获得乌骨鸡黑色素细胞裂解液（BMCL）,探究BMCL对LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症反应的抗炎作用,BMCL对H₂O₂诱导的HUVEC细胞的氧化损伤的保护作用。本研究为进一步阐明乌骨鸡滋补药用、营养作用以及促进乌骨鸡活性成分的开发和利用提供了实验科学依据。主要研究结论归纳如下:1.建立一种测定乌骨鸡肉中黑色素含量的H₂O₂氧化-荧光分析方法。结果表明:乌骨鸡黑色素标准品（600μg/mL）的激发波长为354 nm,发射波长为453 nm,乌骨鸡黑色素在浓度范围50-600μg/mL内的回归方程为y=0.0094X+0.6926,r=0.9986,荧光分析法的方法检出限为0.30μg/mL,紫外分光光度法的方法检出限为3.68μg/mL。荧光分析方法测定的黑色素最低浓度为0.5μg/mL,而紫外分光光度法测定的最低浓度为5μg/mL。样品前处理的最佳条件为:NaOH浓度最佳范围为0.1-0.2 M,超声时间为40 min,超声温度为70℃。乌骨鸡黑色素最佳氧化条件为55℃、氧化时间为2 h,过氧化氢浓度为20%-25%。稳定实验RSD为1.49%、仪器精密度实验RSD值为2.03%。加标回收实验中平均回收率为102.865%,RSD为4.505%,取0.2 g鲜重采用该方法测得腿部肌肉,胸肌和鸡皮肤中的黑色素含量分别为0.879±0.023 mg,0.681±0.012 mg和2.162±0.075 mg,分别占鲜重的0.439%,0.340%,1.081%。以上结果表明该方法准确性较高,且无需从样品中提取黑色素,大大缩短了反应时间,有效地简化了分析操作。2.建立一种测定乌骨鸡黑色素细胞中黑色素含量的H₂O₂氧化-荧光分析方法。结果表明:乌骨鸡黑色素标准品（100μg/mL）的激发波长为354 nm,发射波长为453 nm。乌骨鸡黑色素在浓度范围10-100μg/mL内的回归方程为y=0.0147X+0.3138,r=0.9974,乌骨鸡黑色素最佳氧化条件为55℃、氧化时间为2h,过氧化氢浓度为24%-26%。这与上述确认的乌骨鸡黑色素最佳氧化反应条件基本一致,重复性实验RSD值为4.59%,精密度实验RSD值为1.87%。在A375细胞中添加不同浓度的黑色素标准品（25μg/mL、40μg/mL、80μg/mL）,测定值与理论值的相对误差分别为2.78%、3.53%、0.25%,在乌骨鸡黑色素细胞样品中添加不同浓度的乌骨鸡黑色素标准品,所得的平均加标回收率为95.57%,RSD值为4.00%,结果表明H₂O₂氧化-荧光分析方法测定准确可靠,并且不受胞内杂蛋白和脂质的影响。3.当IBMX浓度在200-500μM之间时,各浓度能显著抑制黑色素细胞的生长（P<0.01）,并且乌骨鸡黑色素细胞存活率随着IBMX的浓度的增加而降低,细胞存活率在40.64%-80.98%之间。浓度为100μM的IBMX对乌骨鸡黑色素细胞的活性并无显著的影响。浓度为100μM和300μM的IBMX相对于空白组能够显著地促进乌骨鸡黑色素细胞中黑色素的合成量（P<0.01）。当IBMX浓度达到400μM时也能显著提高乌骨鸡黑色素细胞中的黑色素含量（P<0.05）。200μM以及500μM的IBMX对黑色素细胞合成黑色素并无显著的促进作用。综上所述,在所试浓度范围内,IBMX能够显著促进乌骨鸡黑色素细胞中黑色素的合成。4.观察RAW264.7细胞的形态,用MTT法测定细胞活力以及测定RAW264.7细胞的NO生成量,探究促进RAW264.7细胞产生炎症的最佳LPS浓度,结果发现LPS为1μg/mL时对细胞毒性最小、NO生成量最大。因此建立了LPS诱导RAW264.7细胞的炎症模型,在此基础上进一步研究了不同浓（0.2-125μg/mL,以乌骨鸡黑色素细胞胞内蛋白的浓度计为细胞的裂解液浓度）乌骨鸡黑色素细胞裂解液对RAW264.7细胞的生长的影响,以及在不同作用时间和不同作用模式下,乌骨鸡黑色素细胞的裂解液在对RAW264.7的NO生成量的影响。结果表明:乌骨鸡黑色素细胞的裂解液浓度在0.2-25μg/mL内对RAW264.7细胞的生长无显著影响,当BMCL浓度上升至25和125μg/mL时,细胞的存活率分别为115.66%和157.50%,和空白组相比有显著的差异（P<0.01）,能够促进RAW264.7细胞的增殖。因此选择1、5、25μg/mL分别作为乌骨鸡黑色素细胞裂解液的低、中和高浓度进行后续实验。在预防模式、共同作用模式以及治疗模式下,浓度为1、5、25μg/mL乌骨鸡细胞的裂解液的对细胞NO生成量有不同程度的影响,相比之下,预防模式下乌骨鸡细胞的裂解液对细胞NO生成的抑制率最大,抗炎效果最明显。当作用不同时间时,高、中和低浓度的乌骨鸡黑色素细胞裂解液均能显著降低细胞NO生成量（P<0.01）。5.钙、铁元素作用后的高（25μg/mL）、中（5μg/mL）和低浓度（1μg/mL）的乌骨鸡黑色素细胞裂解液相对模型组（1μg/mL）均能显著降低RAW264.7细胞的NO的生成量（P<0.01）,这表明钙、铁元素能增强乌骨鸡黑色素细胞裂解液抗炎作用,且氯化钙相对于天门冬氨酸螯合钙更能促进乌骨鸡黑色素细胞裂解液抗炎效果的增强,Fe²⁺的促进作用强于Fe³⁺。6.建立H₂O₂诱导HUVEC细胞损伤的模型,观察细胞形态,运用MTT法测定细胞活力,测定不同浓度的乌骨鸡黑色素细胞裂解液作用后的细胞培养液中LDH活性、SOD酶活性以及MDA含量。结果表明H₂O₂致HUVEC细胞达半数死亡的浓度为1 mM,且该浓度下细胞培养液中的LDH活性值最高,以此浓度建立HUVEC细胞损伤的模型。在此基础上的研究结果表明,浓度为0.2-25μg/mL的乌骨鸡黑色素细胞裂解液对HUVEC细胞活性无显著影响,当浓度达到25μg/mL以上时,对HUVEC细胞生长的促进作用较显著（P<0.01）。本文选择1、5、25μg/mL作为乌骨鸡黑色素细胞裂解液的低、中和高浓度进行后续实验。1和5μg/mL的VC对HUVEC细胞活性无显著影响,选用5μg/mL的VC作为对照组,比较乌骨鸡黑色素细胞裂解液和VC对氧化损伤保护作用的强弱。进一步研究结果表明,相对于模型组（1mM H₂O₂）,高、中浓度的乌骨鸡黑色素细胞裂解液能够显著增加HUVEC细胞的存活率（P<0.01）,同浓度的中浓度的VC并未显增加HUVEC细胞的存活率。高、中和低浓度的乌骨鸡黑色素细胞裂解液能够显著降低细胞培养液中LDH酶活,增加SOD酶活性（P<0.01）。相对于模型组（1 mM H₂O₂）,中浓度的VC对细胞培养液中的LDH酶活和SOD酶活都无显著影响。高、低浓度的乌骨鸡黑色素细胞裂解液能够降低细胞中MDA的含量,相比之下,中浓度的VC也能显著降低MDA含量。综上所述,乌骨鸡黑色素细胞裂解液的对氧化损伤的HUVEC细胞的保护作用强于VC。