本试验旨在通过对四环素类药物色谱分离条件的优化与筛选,分析不同洗脱模式对四环素类药物分离的影响;采用梯度洗脱模式和固相萃取等技术,建立了能同时检测牛奶样品中二甲胺四环素、四环素、金霉素、土霉素、多西环素、去甲基金霉素、甲烯土霉素7种抗生素残留量的反相高效液相色谱方法。1.四环素类药物色谱分离条件的筛选和优化在色谱分离条件的建立中,结合7种四环素类药物理化性质和结构特点,分析了影响四环素类药物分离因素;经过对流动相缓冲液浓度、配比、酸度、流速以及检测波长的多次试验优化和改进现行国家标准中测定四环素类药物的洗脱方式,最终筛选和建立了采用SunfireTM C18(250 mm×4.6 mm,5μm)柱为色谱柱,以甲醇-乙腈-0.01 mol/L草酸为流动相,流速为1.0ml/min和检测波长为355nm的快速分离7种四环素类药物的色谱条件。2.梯度洗脱模式的构建及其影响因子的分析通过对四环素类药物的梯度洗脱条件及其影响因素的系统分析,结果表明,在梯度洗脱模式下,洗脱时间与分离度成正相关;梯度陡度与分离度成负相关;改变有机相浓度变化范围和梯度洗脱程序曲线形状可以获得最佳的分离效果。建立了可使二甲胺四环素等7种四环素类药物达到基线分离的最佳梯度洗脱条件。3.利用固相萃取技术检测牛奶中7种四环素类药物残留本实验采用固相萃取技术,分析和探讨了影响牛奶样品中7种四环素类药物残留的提取、净化和浓缩等过程的主要因素。建立了以pH为4的Mellvaine-EDTA-三氯乙酸缓冲液为提取液的工艺流程;确定了以30%的甲醇水溶液为淋洗试剂(淋洗体积为8mL)、以甲醇-乙酸乙酯溶液作为洗脱液(洗脱速率为1.0mL/min)的HLB固相萃取柱净化的最佳条件。通过前处理方法的得到的7种四环素类抗生素的线性范围宽,峰面积和样品浓度在0.02~1.0μg/mL呈良好的线性关系,加标平均回收率在78.66%~106%,最低检测限为0.02μg/mL。分析评价结果表明,该方法操作简单、重现性好、检测限低、灵敏可靠,并显著降低了分析检测时间,可在18min内能同时将二甲胺四环素等7种四环素类药物达到基线分离。特别是在对牛奶中四环素类抗生素残量的分析时,其最低检测限可达0.02μg/mL,远远低于欧美国家法规中规定的最大残留量,同时回收率均大于78%,而标准偏差小于5.76%。因此,该方法可应用于牛奶中四环素类药物多残留的快速分析,为进一步进行LC-MS确证检测提供了技术依据。