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绿原酸是传统药材金银花抗癌、抗氧化、降糖降脂等药理作用的主要功能成分之一,在医药、食品、日用化工等领域有着广泛应用。通过种植金银花来提取绿原酸的方式远不能满足人们的需求,植物细胞悬浮培养是生产次生代谢产物的新手段,具有不受自然条件约束、生产周期短、便于提取物质等优点,因此研究诱导调控植物细胞悬浮培养体系高效积累绿原酸具有实际意义。本试验以金银花植物为材料,首先通过组织培养技术诱导愈伤组织;其次通过探索适于金银花细胞生长的条件,建立了金银花细胞悬浮培养体系;最后对金银花细胞中的次生代谢物质—绿原酸抑制亚硝化反应进行了研究。主要试验结果如下:(1)愈伤组织诱导和继代条件研究:以愈伤组织的状态及生长倍数为指标,通过单因素试验和正交试验得出愈伤组织诱导的最佳外植体灭菌方式、外植体类型、暗培养时间和激素配比。金银花芽采用70%酒精处理30 s再使用5%的次氯酸钠溶液处理10 min后接种在激素配比为NAA 1.5 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.75 mg/L+6-BA0.15 mg/L的MS培养基中暗培养9d后继续培养可诱导出淡黄色、疏松、易碎的愈伤组织;愈伤组织的生长曲线为S型,24d生长量达最大值;经高效液相法测定,每100g干愈伤组织含绿原酸57 mg;通过正交试验确定适于金银花愈伤组织继代培养的最佳激素组合为6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L。(2)金银花细胞悬浮培养条件研究:以金银花愈伤组织为材料,使用单因素试验和正交试验对接种量、蔗糖浓度、初始pH、激素配比进行试验,优化金银花细胞悬浮体系培养条件。将夹碎的愈伤组织按接种量为0.2g/mL接种到蔗糖浓度为30 g/L、激素配比为6-BA 1.4 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.7 mg/L、初始pH为5.8的MS液态培养基中黑暗培养7-10天可初步建立金银花细胞悬浮培养体系;金银花悬浮细胞的生长曲线分为迟滞期、生长期、衰减期,细胞生长量在第10天达最高,每5mL培养液中含2.512 g细胞,培养7~10天的悬浮细胞生长旺盛,状态良好,可用来进行继代培养;通过倒置显微镜观察,此时的金银花细胞多以2~10个不等的细胞团块形式存在,少数以单个细胞存在;经高效液相检测,每100 g干细胞含有826.7 mg绿原酸。(3)绿原酸和异绿原酸A抑制亚硝化反应研究:金银花细胞的主要成分—绿原酸类物质清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成即抑制亚硝化反应的效果随浓度、反应时间和温度的升高逐渐增强,随pH的升高而降低;清除亚硝酸盐的最适浓度、pH、反应时间、温度分别为5μg/μL、3.4、40 min和47℃;阻断亚硝胺合成的最适浓度、pH、反应时间和温度分别为3μg/μL、2.8、20 min及47℃;抑制亚硝化反应最适条件为样液浓度5ug/uL、pH2.8、反应时间40min、温度47℃。在抑制亚硝化反应方面,绿原酸与Vc效果相当,弱于异绿原酸A,三者的清除效果稍逊于芦丁。因此绿原酸和异绿原酸A都具有较好的抑制亚硝化反应能力,且随反应体系环境的变化而存在差异。