赖氨酰内切酶（Lysyl endopeptidase,Lys-C）是一种胰凝乳蛋白酶型丝氨酸蛋白酶,能特异性酶切赖氨酸羧基侧的肽键。该酶最早于无色杆菌中分离获得,随后来源于产酶溶杆菌的Lys-C实现商业化生产,主要应用于胰岛素药物生产、蛋白质序列分析等领域。Lys-C具有高特异性和高酶切效率的优势,已逐步取代胰蛋白酶、羧肽酶B等蛋白酶,用于一步酶切重组胰岛素原以制备重组人胰岛素。目前,重组人胰岛素已成为治疗糖尿病的大宗药物,其制备过程对Lys-C的需求量不断增加。但是,天然菌株生产的Lys-C产量较低、提取工艺相对复杂,使低成本、规模化工业生产受到诸多挑战。因此,亟待开发Lys-C的高效重组表达工艺,为突破产量瓶颈提供新的路径。本课题利用原核宿主大肠杆菌重组表达Lys-C,并进行该酶的纯化及活性分析。有研究报道,前导肽（pre-N-pro）在Lys-C复性过程中扮演分子伴侣的角色,能够辅助蛋白折叠而显著提高Lys-C的复性效率。因此,本课题在研究过程中也进行了pre-N-pro的重组表达及其复性辅助作用分析。首先,根据NCBI提供的产酶溶杆菌来源Lys-C的编码基因序列,将密码子优化后的前导肽基因和成熟肽基因分别插入不同的表达载体中。本研究选择了以大肠杆菌IPTG诱导型启动子PT7、鼠李糖诱导型启动子PrhaBAD、阿拉伯糖诱导型启动子ParaBAD以及毕赤酵母组成型启动子PGAP、诱导型启动子PAOX1控制目标基因的表达,构建了多个Lys-C和pre-N-pro重组表达菌株。其次,针对上述获得的工程菌株进行摇瓶表达验证,筛选Lys-C高产菌株及探索优化培养条件和诱导策略。研究发现,Lys-C在大肠杆菌中以包涵体形式表达,通过对大肠杆菌培养条件和诱导策略的优化后,菌株JM109DE3PT7-LysC的目标蛋白表达量可达菌体总蛋白量的54%,Lys-C的表达量为13 mg/L。毕赤酵母重组表达pre-N-pro的菌株中,GS115PFBA2LX09-preNpro有少量目标蛋白表达,但摇瓶表达效果不如大肠杆菌重组菌株JM109DE3PT7-preNpro 和JM109DE3PrhaBAD-preNpro。进一步,针对大肠杆菌重组菌株JM109DE3PT7-LysC和JM109DE3PT7-preNpro开展了生物反应器高密度发酵,经工艺优化在诱导8h后可获得湿重约70g/L的菌体,目标蛋白表达量分别可达菌体总蛋白量的60%和19%,Lys-C和pre-N-pro表达量分别为2.4 g/L和0.6 g/L。最后,针对大肠杆菌表达的Lys-C和pre-N-pro进行包涵体复性并探究其蛋白纯化工艺。通过Sephadex G25凝胶过滤层析脱除Lys-C变性液中DTT等杂质,复性后的酶活提升至3 AU/L。为进一步提升Lys-C的复性效率,在Lys-C复性液中添加40～80mg/L复性后的pre-N-pro辅助其蛋白折叠,酶活最高可达13.8AU/L。使用切向流过滤系统浓缩Lys-C复性液,并通过Ni NTA-Sepharose亲和层析、超滤和Sephacryl S-100凝胶过滤层析,实现重组Lys-C的终产量为48 mg/L,纯度为95%,比酶活为10.2 AU/mg。在此基础上,将重组Lys-C样品用于门冬胰岛素前体的酶切检验,结果显示产物转化率可达93.5%。综上,本课题在大肠杆菌和毕赤酵母宿主中采用不同启动子体系对Lys-C及其前导肽pre-N-pro进行了表达分析,通过培养条件的优化实现了大肠杆菌重组菌株高效表达Lys-C。在此基础上,通过复性和纯化策略的优化实现了 Lys-C的高效复性,也为后续纯化策略的深入研究提供了基础。相关研究结果为Lys-C的重组表达和工业应用提供了参考。