论文部分内容阅读
捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是圆线目(Strongylata)毛圆科(Trachostrongylidae)血矛属（Haemonchus）线虫，寄生于牛、羊、骆驼和其他反刍兽的真胃和小肠，因吸血而导致宿主贫血和生产性能下降。目前，捻转血矛线虫病在免疫学研究上有了很大进展，然而，至今只有一个商品化的疫苗，由于该疫苗的生产成本高，其使用范围十分有限。筛选新型高效的疫苗候选抗原具有重要意义。
本实验室前期克隆表达了捻转血矛线虫MMP12A（基质金属蛋白酶）、API（天冬氨酸蛋白酶抑制剂）、HC29（谷胱甘肽氧化物酶）、HC58（半胱氨酸蛋白酶）、H11-2（氨基肽酶）、ENO（烯醇化酶）、ALD（醛缩酶）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）以及AK（精氨酸）等9种蛋白，并对HC29、HC58、H11-2和GAPDH等4种重组蛋白的免疫保护效果进行了研究。为进一步分析这9种蛋白的免疫保护作用，进行了如下研究。
1、MMP12A重组蛋白对山羊的免疫保护性研究
将15只6月龄左右的健康山羊随机分成3个组（免疫攻虫组，不免疫不攻虫对照组，不免疫攻虫对照组），每组5只。第0天采用背部皮下多点注射免疫的方式，将500ug MMP12A重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后对山羊进行首免;第14天用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行第二次免疫;第28天对免疫组以及攻虫不免疫对照组的山羊人工接种5000条捻转血矛线虫三期幼虫。于不同时间点采取山羊全血、血清、粪便、第四胃等样品，对血常规、血清IgG、血清IgA、细胞因子、虫卵计数、成虫荷虫量等指标的动态变化进行分析。
血常规检测结果表明，3组山羊的淋巴细胞和红细胞均在正常范围内波动;攻虫后35天，免疫组和攻虫对照组山羊的嗜酸性粒细胞显著高于不攻虫对照组(P＜0.01)，试验期间未攻虫对照组的嗜酸性粒细胞在正常范围内波动;攻虫后25天，免疫组山羊的血红蛋白和红细胞压积低于正常范围(P＞0.05)，未攻虫对照组血红蛋白和红细胞压积数值均在正常范围内波动。ELISA检测结果表明，2个对照组山羊血清中IgG和IgA的滴度水平低且无明显变化，免疫组IgG在首次免疫后13天达到一个比较高的水平，在攻虫15天后到达峰值(P＜0.01);免疫组山羊血清IgA滴度无明显变化。细胞因子检测结果表明，免疫组的IFN-γ水平在攻虫后第1天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IFN-γ在攻虫后第35天达到峰值(P＜0.05):免疫组的IL-9水平在首免后第13天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IL-9在攻虫后第一天达到峰值(P＞0.05)。IL-17、IL-4和TGF-β变化规律不明显。虫卵和荷虫计数结果表明，未攻虫对照组山羊的虫卵结果为阴性;免疫组与攻虫对照组相比较，免疫组山羊的虫卵数减少了42.14％、荷虫数减少了70.01％。综合以上结果发现，这说明MMP12A重组蛋白对抵御山羊捻转血矛线虫的感染具有良好的免疫保护效果。
2、API重组蛋白对山羊的免疫保护性研究
将15只6月龄左右的健康山羊随机分成3个组（免疫攻虫组，不免疫不攻虫对照组，不免疫攻虫对照组），每组5只。第0天采用背部皮下多点注射免疫的方式，将500ug API重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后对山羊进行首免;第14天用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行第二次免疫;第28天对免疫组以及攻虫不免疫对照组的山羊人工接种5000条捻转血矛线虫三期幼虫。于不同时间点采取山羊全血、血清、粪便、第四胃等样品，对血常规、血清IgG、血清IgA、细胞因子、虫卵计数、成虫荷虫量等指标的动态变化进行分析。
血常规检测结果发现，3组山羊的淋巴细胞和红细胞均在正常范围内波动:攻虫后35天，攻虫对照组的嗜酸性粒细胞显著高于不攻虫对照组(P＜0.01)，免疫组和未攻虫对照组的嗜酸性粒细胞在正常范围内波动;攻虫后25天，免疫组的血红蛋白和红细胞压积低于正常范围(P＞0.05)，未攻虫对照组的山羊血红蛋白和红细胞压积数值均在正常范围内波动。ELISA检测结果表明，2个对照组山羊的血清中IgG和IgA滴度水平低且无明显变化;免疫组山羊IgG滴度在二免后到达峰值(P＜0.01);免疫组山羊IgA滴度在攻虫后5天达到峰值(P＞0.05)。细胞因子检测结果表明:免疫组的IFN-γ水平在攻虫后第1天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IFN-γ在攻虫后第35天达到峰值(P＜0.05);免疫组的IL-9水平在首免后第13天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IL-9在攻虫后的第一天达到峰值(P＞0.05)。IL-17、IL-4和TGF-β变化规律不明显。虫卵和荷虫计数结果表明，未攻虫对照组山羊的虫卵结果为阴性:免疫组与攻虫对照组相比较，免疫组山羊的虫卵数减少了63.20％，荷虫数减少了82.51％。综合以上结果发现，这说明API重组蛋白对抵御山羊捻转血矛线虫的感染具有较好的免疫保护效果。
3、HC29+HC58+HC11-2重组蛋白联合对山羊的免疫保护性研究
将15只6月龄左右的健康山羊随机分成3组（免疫攻虫组、不免疫不攻虫对照组、不免疫攻虫对照组），每组5只。第0天采用背部皮下多点注射免疫的方式，将500ug HC29+HC58+H11-2重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后对山羊进行首免;第14天用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行第二次免疫;第28天对免疫组以及攻虫不免疫对照组的山羊人工接种5000条捻转血矛线虫三期幼虫。于不同时间点采取山羊全血、血清、粪便、第四胃等样品，对血常规、血清IgG、血清IgA、细胞因子、虫卵计数、成虫荷虫量等指标的动态变化进行分析。
血常规检测发现，3组山羊的淋巴细胞和红细胞均在正常范围内波动;攻虫后35天，攻虫对照组的嗜酸性粒细胞显著高于未攻虫对照组(P＜0.01)，免疫组和未攻虫对照组的嗜酸性粒细胞均在正常范围内波动;攻虫后25天，免疫组的血红蛋白和红细胞压积低于正常范围(P＞0.05)，未攻虫对照组山羊的血红蛋白和红细胞压积数值均在正常范围内波动。ELISA检测结果表明，2个对照组山羊的血清中IgG和IgA滴度水平低并无明显变化;免疫组血清IgG滴度二免后13天到达峰值(P＜0.01);免疫组山羊血清IgA滴度攻虫后15天达到峰值(P＞0.05)。细胞因子检测结果表明.免疫组的IFN-γ水平在攻虫后第1天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IFN-γ在攻虫后第35天达到峰值(P＜0.05);免疫组的IL-9水平在攻虫后第1天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IL-9在攻虫后的第一天达到峰值(P＞0.05)。IL-17、IL-4和TGF-β变化规律不明显。虫卵和荷虫计数结果表明，未攻虫对照组山羊的虫卵结果为阴性;免疫组与攻虫对照组相比较，免疫组山羊的虫卵数减少了51.52％，荷虫数减少了54.98％。综合以上结果发现，这说明HC29+HC58+H11-2重组蛋白对抵御山羊捻转血矛线虫的感染具有一定的免疫保护效果。
4、ENO+ALD+GAPDH+AK重组蛋白对山羊免疫保护性研究
将15只6月龄左右的健康山羊随机分成3组（免疫攻虫组、不免疫不攻虫对照组、攻虫不免疫对照组），每组5只。第0天采用背部皮下多点注射免疫的方式，将500ug ENO+ALD+GAPDH+AK重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后对山羊进行首免;第14天用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行第二次免疫;第28天对免疫组以及攻虫不免疫对照组的山羊人工接种5000条捻转血矛线虫三期幼虫。于不同时间点采取山羊全血、血清、粪便、第四胃等样品，对血常规、血清IgG、血清IgA、细胞因子、虫卵计数、成虫荷虫量等指标的动态变化进行分析。
血常规检测表明，3组山羊的淋巴细胞和红细胞均在正常范围内波动;攻虫后35天，攻虫对照组的嗜酸性粒细胞显著高于未攻虫对照组(P＜0.01)，免疫组和未攻虫对照组的嗜酸性粒细胞均在正常范围内波动;攻虫后25天，免疫组山羊的血红蛋白和红细胞压积低于不攻虫对照组(P＜0.05)，未攻虫对照组的山羊血红蛋白和红细胞压积数值均在正常范围内波动。ELISA检测结果表明，2个对照组山羊的血清IgG和IgA滴度水平低且无明显变化，免疫组血清IgG滴度二免后5天到达峰值(P＜0.01);免疫组山羊血清IgA滴度攻虫后15天达到峰值(P＞0.05)。细胞因子检测结果表明，免疫组的IFN-γ水平在攻虫后第1天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IFN-γ在攻虫后第35天达到峰值(P＜0.05);免疫组的IL-9水平在攻虫后第1天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IL-9在攻虫后的第一天达到峰值(P＞0.05)。IL-17、IL-4和TGF-β变化规律不明显。虫卵和荷虫计数结果表明，未攻虫对照组山羊的虫卵结果为阴性;免疫组与攻虫对照组相比较，免疫组山羊的虫卵数减少了33.92％，荷虫数减少率为-28.62％。综合以上结果发现，ENO+ALD+GAPDH+AK重组蛋白在山羊体内能有效的诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，但对驱除捻转血矛线虫荷虫的效果不佳。
本实验室前期克隆表达了捻转血矛线虫MMP12A（基质金属蛋白酶）、API（天冬氨酸蛋白酶抑制剂）、HC29（谷胱甘肽氧化物酶）、HC58（半胱氨酸蛋白酶）、H11-2（氨基肽酶）、ENO（烯醇化酶）、ALD（醛缩酶）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）以及AK（精氨酸）等9种蛋白，并对HC29、HC58、H11-2和GAPDH等4种重组蛋白的免疫保护效果进行了研究。为进一步分析这9种蛋白的免疫保护作用，进行了如下研究。
1、MMP12A重组蛋白对山羊的免疫保护性研究
将15只6月龄左右的健康山羊随机分成3个组（免疫攻虫组，不免疫不攻虫对照组，不免疫攻虫对照组），每组5只。第0天采用背部皮下多点注射免疫的方式，将500ug MMP12A重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后对山羊进行首免;第14天用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行第二次免疫;第28天对免疫组以及攻虫不免疫对照组的山羊人工接种5000条捻转血矛线虫三期幼虫。于不同时间点采取山羊全血、血清、粪便、第四胃等样品，对血常规、血清IgG、血清IgA、细胞因子、虫卵计数、成虫荷虫量等指标的动态变化进行分析。
血常规检测结果表明，3组山羊的淋巴细胞和红细胞均在正常范围内波动;攻虫后35天，免疫组和攻虫对照组山羊的嗜酸性粒细胞显著高于不攻虫对照组(P＜0.01)，试验期间未攻虫对照组的嗜酸性粒细胞在正常范围内波动;攻虫后25天，免疫组山羊的血红蛋白和红细胞压积低于正常范围(P＞0.05)，未攻虫对照组血红蛋白和红细胞压积数值均在正常范围内波动。ELISA检测结果表明，2个对照组山羊血清中IgG和IgA的滴度水平低且无明显变化，免疫组IgG在首次免疫后13天达到一个比较高的水平，在攻虫15天后到达峰值(P＜0.01);免疫组山羊血清IgA滴度无明显变化。细胞因子检测结果表明，免疫组的IFN-γ水平在攻虫后第1天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IFN-γ在攻虫后第35天达到峰值(P＜0.05):免疫组的IL-9水平在首免后第13天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IL-9在攻虫后第一天达到峰值(P＞0.05)。IL-17、IL-4和TGF-β变化规律不明显。虫卵和荷虫计数结果表明，未攻虫对照组山羊的虫卵结果为阴性;免疫组与攻虫对照组相比较，免疫组山羊的虫卵数减少了42.14％、荷虫数减少了70.01％。综合以上结果发现，这说明MMP12A重组蛋白对抵御山羊捻转血矛线虫的感染具有良好的免疫保护效果。
2、API重组蛋白对山羊的免疫保护性研究
将15只6月龄左右的健康山羊随机分成3个组（免疫攻虫组，不免疫不攻虫对照组，不免疫攻虫对照组），每组5只。第0天采用背部皮下多点注射免疫的方式，将500ug API重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后对山羊进行首免;第14天用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行第二次免疫;第28天对免疫组以及攻虫不免疫对照组的山羊人工接种5000条捻转血矛线虫三期幼虫。于不同时间点采取山羊全血、血清、粪便、第四胃等样品，对血常规、血清IgG、血清IgA、细胞因子、虫卵计数、成虫荷虫量等指标的动态变化进行分析。
血常规检测结果发现，3组山羊的淋巴细胞和红细胞均在正常范围内波动:攻虫后35天，攻虫对照组的嗜酸性粒细胞显著高于不攻虫对照组(P＜0.01)，免疫组和未攻虫对照组的嗜酸性粒细胞在正常范围内波动;攻虫后25天，免疫组的血红蛋白和红细胞压积低于正常范围(P＞0.05)，未攻虫对照组的山羊血红蛋白和红细胞压积数值均在正常范围内波动。ELISA检测结果表明，2个对照组山羊的血清中IgG和IgA滴度水平低且无明显变化;免疫组山羊IgG滴度在二免后到达峰值(P＜0.01);免疫组山羊IgA滴度在攻虫后5天达到峰值(P＞0.05)。细胞因子检测结果表明:免疫组的IFN-γ水平在攻虫后第1天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IFN-γ在攻虫后第35天达到峰值(P＜0.05);免疫组的IL-9水平在首免后第13天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IL-9在攻虫后的第一天达到峰值(P＞0.05)。IL-17、IL-4和TGF-β变化规律不明显。虫卵和荷虫计数结果表明，未攻虫对照组山羊的虫卵结果为阴性:免疫组与攻虫对照组相比较，免疫组山羊的虫卵数减少了63.20％，荷虫数减少了82.51％。综合以上结果发现，这说明API重组蛋白对抵御山羊捻转血矛线虫的感染具有较好的免疫保护效果。
3、HC29+HC58+HC11-2重组蛋白联合对山羊的免疫保护性研究
将15只6月龄左右的健康山羊随机分成3组（免疫攻虫组、不免疫不攻虫对照组、不免疫攻虫对照组），每组5只。第0天采用背部皮下多点注射免疫的方式，将500ug HC29+HC58+H11-2重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后对山羊进行首免;第14天用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行第二次免疫;第28天对免疫组以及攻虫不免疫对照组的山羊人工接种5000条捻转血矛线虫三期幼虫。于不同时间点采取山羊全血、血清、粪便、第四胃等样品，对血常规、血清IgG、血清IgA、细胞因子、虫卵计数、成虫荷虫量等指标的动态变化进行分析。
血常规检测发现，3组山羊的淋巴细胞和红细胞均在正常范围内波动;攻虫后35天，攻虫对照组的嗜酸性粒细胞显著高于未攻虫对照组(P＜0.01)，免疫组和未攻虫对照组的嗜酸性粒细胞均在正常范围内波动;攻虫后25天，免疫组的血红蛋白和红细胞压积低于正常范围(P＞0.05)，未攻虫对照组山羊的血红蛋白和红细胞压积数值均在正常范围内波动。ELISA检测结果表明，2个对照组山羊的血清中IgG和IgA滴度水平低并无明显变化;免疫组血清IgG滴度二免后13天到达峰值(P＜0.01);免疫组山羊血清IgA滴度攻虫后15天达到峰值(P＞0.05)。细胞因子检测结果表明.免疫组的IFN-γ水平在攻虫后第1天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IFN-γ在攻虫后第35天达到峰值(P＜0.05);免疫组的IL-9水平在攻虫后第1天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IL-9在攻虫后的第一天达到峰值(P＞0.05)。IL-17、IL-4和TGF-β变化规律不明显。虫卵和荷虫计数结果表明，未攻虫对照组山羊的虫卵结果为阴性;免疫组与攻虫对照组相比较，免疫组山羊的虫卵数减少了51.52％，荷虫数减少了54.98％。综合以上结果发现，这说明HC29+HC58+H11-2重组蛋白对抵御山羊捻转血矛线虫的感染具有一定的免疫保护效果。
4、ENO+ALD+GAPDH+AK重组蛋白对山羊免疫保护性研究
将15只6月龄左右的健康山羊随机分成3组（免疫攻虫组、不免疫不攻虫对照组、攻虫不免疫对照组），每组5只。第0天采用背部皮下多点注射免疫的方式，将500ug ENO+ALD+GAPDH+AK重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后对山羊进行首免;第14天用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行第二次免疫;第28天对免疫组以及攻虫不免疫对照组的山羊人工接种5000条捻转血矛线虫三期幼虫。于不同时间点采取山羊全血、血清、粪便、第四胃等样品，对血常规、血清IgG、血清IgA、细胞因子、虫卵计数、成虫荷虫量等指标的动态变化进行分析。
血常规检测表明，3组山羊的淋巴细胞和红细胞均在正常范围内波动;攻虫后35天，攻虫对照组的嗜酸性粒细胞显著高于未攻虫对照组(P＜0.01)，免疫组和未攻虫对照组的嗜酸性粒细胞均在正常范围内波动;攻虫后25天，免疫组山羊的血红蛋白和红细胞压积低于不攻虫对照组(P＜0.05)，未攻虫对照组的山羊血红蛋白和红细胞压积数值均在正常范围内波动。ELISA检测结果表明，2个对照组山羊的血清IgG和IgA滴度水平低且无明显变化，免疫组血清IgG滴度二免后5天到达峰值(P＜0.01);免疫组山羊血清IgA滴度攻虫后15天达到峰值(P＞0.05)。细胞因子检测结果表明，免疫组的IFN-γ水平在攻虫后第1天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IFN-γ在攻虫后第35天达到峰值(P＜0.05);免疫组的IL-9水平在攻虫后第1天达到峰值(P＜0.01)，攻虫对照组的IL-9在攻虫后的第一天达到峰值(P＞0.05)。IL-17、IL-4和TGF-β变化规律不明显。虫卵和荷虫计数结果表明，未攻虫对照组山羊的虫卵结果为阴性;免疫组与攻虫对照组相比较，免疫组山羊的虫卵数减少了33.92％，荷虫数减少率为-28.62％。综合以上结果发现，ENO+ALD+GAPDH+AK重组蛋白在山羊体内能有效的诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，但对驱除捻转血矛线虫荷虫的效果不佳。