犬库布病毒（Canine kobuvirus,CaKoV）是一种与犬腹泻相关的病毒。自2011年美国首次报道以来,在欧洲和亚洲多个国家以及我国的西南地区和东北地区均有该病的报道,给犬的健康造成了严重的威胁。截至目前,在安徽省尚无CaKoV感染病例的报道,其遗传进化背景尚不明确,有待深入研究。此外,快速检测手段对于该病的早期诊断具有重要的意义。本研究共收集了57份来自安徽不同地区的腹泻和健康犬的粪便样本,利用特异性检测引物共检测出5份CaKoV。随后,成功扩增出5株病毒VP1基因序列,并对其中一株的全基因组序列进行了扩增。利用Mega X软件,对5株CaKoV VP1基因开展了遗传进化分析。结果表明,基于VP1基因的遗传进化分析,5株犬库布病毒VP1基因同源性在94.0%-96.4%之间,其中AH-1和AH-3同源性最低为94%,AH-1和AH-4同源性最高为96.4%,遗传进化树分析表明全球CaKoV可能分为两个大群,其中亚洲地区的流行毒株为单独的一群,欧洲和美洲国家流行株为另外一群。基于全基因组序列的分析结果显示,CaKoV安徽株与亚洲地区的野毒株具有较近的遗传关系,与亚洲野毒株的同源性可达到93.3%-98.7%,与欧洲的核苷酸同源性为80.1%-85.5%,与欧洲和美洲地区的毒株亲缘关系较远,表明CaKoV的流行可能具有地方流行性的特征。基于多物种库布病毒遗传进化分析结果表明,CaKoV与猫库布病毒的亲缘关系较近,与牛、羊和猪等大动物的库布病毒亲缘关系较远,说明犬猫的库布病毒可能存在跨物种传播的情况。进一步对CaKoV VP1进行分析发现,VP1蛋白的优势B细胞抗原表位为该蛋白的第60～67、112～117和240～247位;VP1蛋白的优势Th细胞抗原表位分别在该蛋白的第107-115位的LRISNPNGL,49-57位的FYRLLPLGS,第143-150位的FMAETPIP以及第250-259位的VVKQGAHTS。此外,第119-127位的LLIAYAPPG可能是VP1蛋白的Th表位。这些信息可为后续特异性抗体的制备提供参考信息。利用MDCK和CRFK敏感细胞系,初步分离培养了1株CaKoV,为后续该病毒的致病机制研究提供了宝贵的生物材料。本研究首次明确了安徽省存在CaKoV的感染,并进一步了解CaKoV的系统发育和分子演化规律,同时初步分离得到CaKoV的分离株。在检测方法建立方面,本研究利用Beacon Designer 7.0软件,针对CaKoV保守基因3D基因设计了一对特异性引物,建立了一种基于SYBR Green I的实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法具有良好的特异性,不与其他常见的犬的病毒发生非特异性扩增反应;最低检测限为10 copies/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍;组内和组间的变异系数均小于0.5%。该检测方法具有良好的特异性、较高的灵敏度和较好的重复稳定性,可为CaKoV的快速诊断提供有效的技术支持。临床样本检测结果表明,本研究中建立的针对CaKoV的实时荧光定量PCR的阳性检出率高于普通PCR检出率,表明实时荧光定量PCR更适用于一线临床的检测中。