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目的白血病是一组基因组发生动态变化的异质性造血干／祖细胞疾病,以异常造血细胞的恶性增殖、分化受阻、凋亡受抑制并造成正常血细胞减少为特征。大约45%的急性髓系白血病患者在常规染色体核型分析时检测不到染色体畸变,为正常核型,但这种亚型的患者在分子遗传变异和治疗效果上存在异质性。亚显微上的遗传学损伤不仅与疾病的发病机制有关,还影响其治疗反应性和生存率。在正常核型急性髓系白血病(CN-AML)中常见的分子畸变有核磷蛋白(NPM)基因突变和fms样酪氨酸激酶3(FLT3)基因内部串联重复(ITDs)。在低比例的CN-AML患者中也发现其他分子异常,包括预示良好预后的CEBPA(CCAAT/增强子结合蛋白α)基因突变以及MLL基因部分串联重复(MLL-PTDs)。近来,利用实时定量PCR技术测定出一些基因(ERG,BAALC等)表达水平定量上的差别,为CN-AML的预后提供了重要的信息。然而,这些危险因素间的相互关系和相对重要性研究还较为少见。本文我们利用荧光定量PCR技术联合检测一组具有典型特征的CN-AML患者ERG基因和BAALC基因的转录水平,从而探讨不同分子标记与预后的关系以及他们之间的相互关系,为这部分患者进一步精细分型进而分层治疗提供新的理论依据。方法一、实验材料收集中国医科大学附属盛京医院血液病治疗中心2008年1月-2009年1月住院的初治急性髓系白血病患者(62例)EDTA抗凝骨髓液(各3-5ml),其中男30例,女32例,年龄在20-77岁之间,中位年龄54.5岁。所有病例经细胞形态学、细胞化学染色、流式细胞术免疫分型及PCR融合基因检测确诊为AML(FAB),染色体分析采用R显带技术,至少分析20个克隆,均未检测到核型异常。其中包括：M01例,M13例,M219例,M411例,M524例,M64例；20例非恶性血液病患者作为正常对照。实验组患者接受诱导缓解方案或强烈化疗方案。二、实验方法抗凝骨髓液经Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离单个核细胞(MNC)；提取细胞总RNA；配置逆转录反应体系20μl合成cDNA；引物由Takara公司设计合成,采用实时定量RT-PCR SYBR Green I方法检测ERG和BAALC mRNA表达水平,以GAPDH作为内参照。三、结果判断将标准品cDNA10倍浓度梯度稀释为5-6个浓度梯度,各取2μl作为模板进行Real Time PCR反应,由各扩增曲线得到的Ct值制作标准曲线,从而得到样本的拷贝数。以GAPDH作为内参照,ERG和BAALC作为目的基因,通过目的基因和内参基因拷贝数的比值进行样本间相对定量的比较。四、统计学分析方法应用SPSS13.0版统计软件进行数据分析,分别以患者ERG基因相对表达量第75百分位数(P75)和BAALC基因相对表达量中位数为界,分为高表达和低表达2组,对于分类变量资料应用χ2检验,对于连续变量资料应用Mann-Whitney U检验进行统计学分析,应用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析,相互比较使用Log-rank检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、方法的可靠性和准确性(1)RNA的纯度和质量分析所提取的总RNA经核酸蛋白分析仪检测,OD260／OD280在1.8-2.0之间,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,28S和18S条带清晰可见,说明总RNA无明显降解。(2)扩增的特异性及定量的准确性标准品cDNA经梯度稀释后进行PCR反应,制作标准曲线。得到的标准曲线相关系数(r2)均>0.998,斜率在-3.3至-3.5之间,反映定量准确,扩增效率良好。扩增后熔解曲线显示锐利的单一峰,熔解温度均一,说明扩增产物均一,无非特异扩增及引物二聚体。琼脂糖凝胶电泳进一步验证扩增片段的均一性及长度。2、ERG和BAALC基因在正常核型急性髓系白血病中的表达CN-AML组ERG基因及BAALC基因表达均显著高于非恶性血液病组(P值均小于0.05)。3、ERG和BAALC基因与正常核型急性髓系白血病患者临床资料的关系(1)ERG基因高表达组患者白细胞计数增高(P<0.05),骨髓原始细胞比例较高(P<0.05),FAB分型中M0／M1比例偏高。(2)BAALC基因高表达组患者白细胞计数增高(P<0.05),CD34表达率较高(P<0.05),FAB分型中M0／M1比例偏高。4、ERG和BAALC基因与正常核型急性髓系白血病预后的关系ERG和BAALC基因高表达组患者CR率显著低于低表达组(40%vs 74%；P<0.05,46% vs 79%；P<0.05),ERG和BAALC基因高表达组一年OS率显著低于低表达组(33%vs 69%；P<0.05,36%vs 72%；P<0.05)。5、ERG和BAALC基因表达相互关系及与预后的关系在BAALC基因低表达的情况下,高水平的ERG预示着低的OS率(P<0.05),而BAALC高表达时,高表达的ERG对预后则无明显影响(P>0.05)。ERG和BAALC均低表达的患者一年OS率高于ERG或／和BAALC高表达组患者(P<0.05)。结论1、CN-AML患者ERG基因和BAALC基因表达水平显著高于非恶性血液病患者。2、ERG基因和BAALC基因高表达患者均在FAB分型原始类型中较多见,且与干细胞标志CD34分子表达相关。3、ERG基因和BAALC基因高表达组患者CR率低,OS率低,为CN-AML患者预后不良的分子标记。4、ERG和BAALC均低表达的患者预后相对较好,联合定量检测两种基因表达水平有助于对CN-AML患者进行精确危险度分型和分层治疗,对预后进行更准确的评估。