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猪圆环病毒相关疾病（Porcine Circovirus Associated Disease,PCVAD）是由猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）引起的一系列生殖疾病、肠道疾病和呼吸道疾病的综合征。近年来,PCV2不断有新的亚型出现,猪场疫苗免疫失败的情况频发,给养猪业带来巨大的经济损失。PCV2编码能力有限,复制过程需要借助细胞蛋白的辅助。关于PCV2复制起始过程的研究非常有限,PCV2 Ori DNA是病毒复制复合体组装及PCV2复制的起始位点,包含一段保守的茎环结构（Stem-loop,SL）。是否有细胞蛋白结合到Ori序列上参与PCV2的复制启动,目前仍没有任何报道。本论文针对上述问题开展研究,筛选与PCV2 Ori互作的宿主蛋白,并初步探究其影响病毒复制的分子机制。具体的研究内容和结果如下:1.PCV2 Ori DNA互作宿主蛋白的筛选与分析利用DNA-protein pull down实验将PCV2 Ori DNA与PK-15细胞裂解液孵育,筛选细胞中与PCV2 Ori DNA互作的宿主蛋白,LC-MS/MS技术进行蛋白鉴定,共鉴定到130个可能与PCV2 Ori DNA互作的宿主蛋白。GO分析表明,约70%的蛋白位于细胞核内;分子功能上,116种具有蛋白结合功能,65种与DNA结合相关。KEGG通路富集分析表明,互作蛋白主要参与遗传信息处理过程,其中参与DNA复制与修复、翻译及转录功能的蛋白数量最多。蛋白质互作网络也提示DNA损伤修复通路的蛋白质可能参与PCV2基因组的复制起始,其中,互作关系最多的蛋白为PARP1。根据质谱鉴定结果中的蛋白评分以及上述功能与通路分析,选择细胞NCL、PARP1、HNRNPU蛋白进一步研究。2.PCV2 Ori DNA与细胞NCL、PARP1、HNRNPU蛋白互作通过实验验证PCV2 Ori DNA与细胞蛋白的相互作用。DNA-protein pull down实验表明,PCV2 Ori DNA片段能够与细胞裂解液中的NCL及PARP1蛋白结合。免疫共沉淀实验结合荧光定量分析结果表明,NCL及PARP1蛋白在细胞内对PCV2 Ori DNA有极显著的结合能力。琼脂糖凝胶迁移实验验证了HNRNPU蛋白与Ori片段和PCV2基因组都存在互作。进一步对细胞蛋白与Ori的互作区域进行研究,发现NCL、PARP1蛋白与PCV2 Ori的茎环区域互作。综上,NCL、PARP1、HNRNPU均与PCV2基因组Ori互作,其中NCL、PARP1与PCV2 Ori DNA的茎环区域互作。3.细胞NCL、PARP1、HNRNPU蛋白对PCV2复制的影响为了研究宿主蛋白对PCV2复制的影响,分别对NCL、PARP1、HNRNPU基因进行过表达或沉默表达,并分析对PCV2基因组拷贝数的影响。构建了NCL、PARP1、HNRNPU真核表达质粒,转染HEK-293T细胞,结果显示,NCL和PARP1过表达后PCV2基因组拷贝数增加。使用si RNA沉默NCL、PARP1基因后,PCV2基因组拷贝数下降,说明NCL和PARP1蛋白正调控PCV2复制。过表达或沉默HNRNPU基因对PCV2复制没有显著影响。4.细胞NCL、PARP1、HNRNPU蛋白与病毒蛋白的互作为了研究细胞蛋白在病毒复制和包装中发挥的作用,在HEK-293T细胞中表达不同标签的病毒蛋白和细胞蛋白,取等量的细胞裂解液分别加入两种标签抗体的磁珠中进行Co-IP（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）实验。结果表明,PARP1蛋白与Cap、Rep蛋白均存在相互作用,而NCL和HNRNPU蛋白不与Cap、Rep蛋白互作。5.PARP1蛋白促进PCV2复制复合体的组装在表达Rep的同时分别共表达NCL或PARP1基因,研究在NCL或PARP1过表达的情况下,Rep蛋白与Ori的结合是否受到影响。结果表明,在PARP1过表达的情况下,Rep蛋白结合PCV2 Ori的能力增强,而NCL过表达不影响Rep蛋白与PCV2基因组Ori的结合。表明PARP1蛋白促进Rep蛋白与PCV2 Ori的识别和结合,促进病毒复制复合体的组装,从而加速PCV2的复制。综上,本研究共筛选到了三个与PCV2复制起始区互作的宿主蛋白,PARP1、NCL蛋白与复制起始区的茎环结构互作并促进病毒复制,PARP1蛋白与病毒衣壳蛋白Cap及复制蛋白Rep均互作,并促进病毒复制复合体在复制起始区的装配。为PCV2药物靶标的选择及PCV2复制起始过程的研究奠定基础。