论文部分内容阅读
植物病害给农业生产造成严重损失,最经济、有效的防治策略是选育和利用抗病品种。通过对植物免疫信号调控机制的研究,可为植物抗病育种提供基因资源。由转录因子构建的信号调控网络在植物面对病原侵染时可以缓解或消除病原带来的危害。目前,已有研究显示转录因子参与调控植物的气孔免疫,但具体调控机制尚不清楚。本研究围绕BBX家族转录因子CCT1和b ZIP家族转录因子b ZIP59,分别对其在气孔免疫和质外体免疫中发挥的作用展开研究,主要获得以下结果:1.CCT1参与拟南芥对Pst DC3000的气孔免疫和质外体免疫CCT1在拟南芥保卫细胞中组成性表达并响应细菌Pseudomonas syringae pv.tomato strain（Pst）DC3000的诱导。当浸菌接种Pst DC3000时,CCT1突变减弱拟南芥对Pst DC3000的抗性,而CCT1过表达增强拟南芥对Pst DC3000的抗性;进一步研究发现CCT1过表达抑制Pst DC3000和COR诱导的气孔重新开放,提示CCT1通过抑制COR信号正调控拟南芥对Pst DC3000的气孔免疫。当注射接种Pst DC3000时,CCT1突变和过表达也分别减弱和增强拟南芥对Pst DC3000的抗性;在质外体中,CCT1突变抑制了来源于Pst DC3000的PAMP flg22诱导的ROS积累、MAPK激酶活性、胼胝质积累,而CCT1过表达增强了这些PTI反应,表明CCT1通过flg22诱导的防卫信号正调控拟南芥对Pst DC3000质外体免疫。此外,利用Ch IP-seq在全基因组范围内筛选CCT1的结合靶标,发现靶基因与“跨膜运输或离子通道”、“ROS合成过程”、“激酶活性”等防卫信号途径相关,提示CCT1参与拟南芥对Pst DC3000的气孔免疫和质外体免疫可能由这些信号途径介导的。2.NAC53调控CCT1参与拟南芥对Pst DC3000的抗性利用酵母单杂交技术筛选到与CCT1启动子互作的NAC53转录因子。生物信息学分析显示NAC53在保卫细胞中高丰度表达并响应Pst DC3000的诱导。转录激活活性和亚细胞定位分析发现NAC53是具有转录激活活性的核蛋白。对CCT1启动子进行截短分析,发现启动子序列的-1到-264位是NAC53与CCT1启动子互作的关键区段。在此基础之上,利用凝胶迁移实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）明确NAC53结合CCT1启动子的最小特征序列为CCCAAGAAA。双荧光素酶实验发现NAC53对CCT1的调控是正向的。此外,利用CRISPR/Cas9基因编辑获得NAC53的敲除突变体,发现NAC53突变抑制了Pst DC3000诱导的CCT1表达并减弱了拟南芥对Pst DC3000抗性,表明NAC53通过调控CCT1参与拟南芥对Pst DC3000的抗性。3.b ZIP59调节拟南芥对Pst DC3000气孔免疫,并调节对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）和核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的质外体免疫本课题组前期研究发现b ZIP59参与Pst DC3000和flg22诱导的气孔关闭。基于此,浸菌接种Pst DC3000发现b ZIP59突变减弱了拟南芥对Pst DC3000的抗性,而注射接种Pst DC3000发现b ZIP59突变不影响拟南芥对Pst DC3000的抗性,表明b ZIP59正调控拟南芥对Pst DC3000的气孔免疫。此外,b ZIP59突变减弱了拟南芥对活体营养型病原TMV的抗性,而增强了拟南芥对死体营养型真菌核盘菌的抗性,这与RNA-seq显示b ZIP59正调控和负调控防卫相关基因的表达有关。Ch IP-seq和EMSA显示b ZIP59不仅可以结合含ACGT核心序列的Atf1和Atf7 motif,还可以结合新鉴定的KAN1 motif。综上,本研究发现CCT1和b ZIP59正调控拟南芥对Pst DC3000气孔免疫。不同的是,CCT1还通过flg22诱导的防卫信号正调控拟南芥对Pst DC3000的质外体免疫,而b ZIP59并不参与拟南芥对Pst DC3000的质外体免疫。此外,b ZIP59调控拟南芥质外体对活体营养型病原TMV和死体营养型真菌核盘菌相反的抗性。研究结果为转录因子在气孔免疫和质外体免疫的两个层面中扮演不同角色提供参考,也为植物在面临不同病原侵染时的细胞型特异性策略提供理论依据。