脂肪酶(E.C.3.1.1.3)亦称酰基甘油水解酶,在粮油生产、食品工业、化学工业、农业等许多领域有广泛应用。其中米黑霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase, RML,基因编号：A34959)是一种能够专一性水解甘油三酯1,3位酯键的脂肪酶,水解得到的二酯和单酯在工业中具有更广泛的应用价值。天然的RML包括24个氨基酸组成的信号肽,70个氨基酸组成的前导肽,以及269个氨基酸组成的成熟蛋白。成熟蛋白的理论相对分子质量为31.6kD。本课题的研究对象仅包括前导肽和成熟区。研究首次利用大肠杆菌原核表达体系对目的基因进行高效表达。通过3种方式提高了RML在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量：1.低温诱导(16℃)RML表达；2.新型分子伴侣(Skp)与RMLN端融合表达；3.载体pET32a上的Trx·tag与RMLN端融合表达。研究证明低温诱导RML的表达效果最好,蛋白表达量是37℃诱导结果的5.4倍,说明诱导温度是影响可溶性蛋白表达量的关键因素。前导肽是一类能够帮助其相连蛋白正确折叠的多肽,课题首次发现RML在大肠杆菌体内表达后,其前导肽不被切去。而若在克隆过程中人为去掉前导肽序列后,RML在大肠杆菌体内没有表达。这一现象说明RML的前导肽对其成熟蛋白的正确折叠具有重要作用,并指出在后续对RML进行改造的研究中应以包括前导肽的RML全蛋白为研究对象。提高脂肪酶的催化比活力,是降低脂肪酶生产成本的有效途径之一。研究在RML全蛋白结构未知的前提下,首先采取易错PCR方式引入随机突变,再通过有效的高通量筛选方法挑出理想的突变体；其次,通过对RML前导肽与成熟区域折叠方式的正确分析,得出RML成熟区域是相对于前导肽独立折叠的结论,其空间结构(PDB:3TGL)可作为蛋白改造的参考依据；最后,参考RML成熟蛋白结构,对易错PCR得到的突变位点进行筛选,再通过定点突变和饱和突变持续提高RML的活性和耐热性。据此,研究充分利用定向进化的各种策略对酶进行成功的改造,共包括4轮易错PCR、2次定点突变和4轮饱和突变。不仅使RML水解甘油三酯的活性得到明显提高,还使其耐热性得到改良。研究共挑选出15株理想突变体,其中M13(D48V/V67A/S168P/S240V/S311C/D313H)的比活可达到3609±100U/mg,为野生型RML水解活性的14.3倍；而M15(D48V/V67A/S168P/S240A/S311C/D313H)具有最理想耐热性,其经70℃两小时热处理后,保留活性达1316±50U/mg,而这一数值是野生型RML不经热处理水解活性的5.2倍。高活性和高耐热性的酶对于工业的应用更为广泛。因此,在利用定向进化技术对酶进行改造的设计中,不能仅局限于一种方式,而多角度结合,利用“半理性设计”思想才会有更好的效果。本课题还首次研究了前导肽在脂肪酶定向进化中的作用。尽管前导肽的作用被普遍认为是帮助其相连蛋白的正确折叠,RML的前导肽和成熟蛋白在空间构象上也是相互独立折叠的两部分,然而RML定向进化结果仍有力指出前导肽的突变提高了目的蛋白的水解活性。通过对源于脂肪酶家族23段前导肽序列的二级结构比对分析,发现前导肽的N末端和C末端多以疏水性氨基酸为主,并且RML前导肽的突变也多集中于N末端或C末端,并趋向于疏水性氨基酸的突变。这一结果显示：RML前导肽的突变向着有利于其自身折叠过程中形成“稳定内核”的方向发展,这有利于帮助RML成熟区更“完美”的折叠,进而影响其比活。因此,高活性的突变体是在RML前导肽和成熟区的协同作用下,共同进化的结果。前导肽的进化在这一过程中显得尤为重要,我们不应把目光仅局限于成熟区的改造,这为那些天然状态下同样包括前导肽的蛋白的进化提出新的策略。