研究背景和目的急性心肌缺血坏死影响了心肌的收缩及舒张功能,可导致心律失常、心力衰竭、猝死等心血管事件的发生。近年来,可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase, sEH)作为心血管疾病的治疗靶点受到关注,研究表明,抑制sEH可使缺血、缺氧的心肌细胞凋亡减少,从而使心肌梗死面积缩小、促进心功能的恢复,缓解慢性压力超负荷诱导的心肌肥厚和防治心肌重构。目前,应用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术来抑制sEH的表达,从而起到保护心血管系统作用的报道尚少。RNAi是一种转录后基因沉默机制,即mRNA被相应的小干扰RNA(short interference RNA, siRNA)结合后发生降解或被封闭,从而阻止mRNA修饰和翻译。RNAi这种于转录后水平的基因调控,具有高度特异性、高效性和低毒性等特点,微量的siRNA就可使目的基因的表达显著下降。本实验拟构建靶向sEH基因的siRNA表达质粒,培养小鼠原代心肌细胞,并通过将siRNA表达质粒转染入心肌细胞的方法,筛选出针对sEH基因特异性沉默效果较好的siRNA表达质粒。用筛选出的质粒抑制心肌细胞sEH的表达,观察其对异丙肾上腺素(Isoproterenol, ISO)诱导的心肌细胞凋亡的影响。将筛选出的siRNA表达质粒注入小鼠体内,然后采用高剂量异丙肾上腺素腹腔注射的方法,建立小鼠急性心肌缺血模型,观察心肌组织sEH的表达能否被显著下调,以及当小鼠体内的sEH表达被抑制后,对急性缺血损伤的心肌和心功能的影响,还有对心肌组织凋亡相关基因Bcl-2及Bax的表达水平产生的影响,并对相关机制进行探讨。第一部分BALB/c小鼠乳鼠原代心肌细胞的分离、培养和鉴定目的：建立分离、纯化和培养BALB/c小鼠乳鼠心肌细胞的方法。方法：取出生1-3d以内的BALB/c小鼠乳鼠心肌组织,用0.125%胰蛋白酶和0.1%的I型胶原酶进行消化,将心肌细胞收集到含15%胎牛血清的DMEM培养基中,用差速贴壁分离法同5-溴脱氧尿苷相结合的方法,以分离和纯化心肌细胞。通过对细胞内的a-actin进行免疫组化染色的方法,来鉴定培养的细胞是否为心肌细胞。结果：16-24h后可见散在的单个或多个细胞搏动,2-3d后可见细胞相互连接,出现同步、有节律的搏动；经过对细胞内的a-actin免疫组化染色鉴定后,确认培养的细胞基本都是心肌细胞。结论：通过本研究应用的方法,可培养、获得状态良好的BALB/c小鼠原代心肌细胞,是一种可靠的心肌细胞培养方法。第二部分RNA干扰下调小鼠心肌细胞可溶性环氧化物水解酶的表达目的：构建靶向可溶性环氧化物水解酶(Soluble Epoxide Hydrolase, sEH)基因的pSUPER.retro.neo表达质粒,其内含有特异性靶向sEH的RNA干扰序列,以选择性下调小鼠原代心肌细胞sEH的表达,并筛选出抑制sEH效果最明显的表达质粒。方法：设计异性靶向sEH的小干扰RNA(short interference RNA, siRNA)序列,构建2个含有该特异性siRNA序列的质粒(EH-1、EH-2)。以含非特异性siRNA编码序列的PCN质粒为阴性对照(PCN组),用FuGENE HD将质粒转染进入培养的原代心肌细胞,并设空白对照组(C组)。转染后,通过半定量RT-PCR和Western blotting法,检测各组心肌细胞sEH的mRNA和蛋白的表达情况。结果：在C组、PCN组和EH-1组,心肌细胞sEH的mRNA和蛋白质表达均无降低；与这些组相比,在EH-2组,可观察到心肌细胞sEH的mRNA和蛋白质表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。表明质粒EH-2为抑制sEH效果最明显的表达质粒,重新命名为EH-R。结论：可以通过构建含特异性siRNA序列的质粒,利用RNAi技术成功下调了原代培养的心肌细胞中sEH的表达。第三部分RNA干扰下调可溶性环氧化物水解酶表达对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞凋亡的影响目的：应用抑制sEH效果最明显的表达质粒EH-R,抑制心肌细胞的sEH表达；观察其对异丙基肾上腺素(Isoproterenol, ISO)诱导的心肌细胞的凋亡及相关基因的影响。方法：以含非特异性siRNA编码序列的质粒(PCN)为阴性对照,用FuGENE HD转染原代培养的心肌细胞,利用抑制sEH效果最明显的表达质粒EH-R,下调心肌细胞sEH基因的表达。采用浓度为10μmol/L的ISO诱导心肌凋亡,心肌细胞被分为四组：正常对照组、ISO组、PCN+ISO组和EH-R+ISO组。观察抑制sEH后,对ISO诱导的心肌细胞凋亡的影响,流式细胞仪检测各组细胞凋亡的发生率,Western blotting法检测各组Bcl-2和Bax蛋白的表达变化。结果：与正常对照组相比,应用ISO的各组的心肌细胞凋亡率明显升高,并且心肌细胞的Bax表达升高,而Bcl-2表达下降,差异有统计学意义(P<0.01)。然而,EH-R+ISO组与ISO组、PCN+ISO组相比较,心肌细胞凋亡率明显降低(P<0.01),心肌细胞的Bax表达降低,Bcl-2表达升高(P<0.01)。结论：应用质粒EH-R成功下调了原代培养的心肌细胞中sEH的表达,从而相对增加了抑凋亡基因Bcl-2的表达,减轻了ISO诱导心肌细胞的凋亡。第四部分RNA干扰下调可溶性环氧化物水解酶表达对异丙肾上腺素诱导的急性心肌缺血坏死的影响目的：应用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术下调BALB/c小鼠体内的可溶性环氧化物水解酶(Soluble Epoxide Hydrolase, sEH)的表达,观察抑制sEH表达后,对异丙基肾上腺素(Isoproterenol, ISO)诱导的急性缺血心肌和心功能的影响,并观察心肌组织凋亡相关基因的变化。方法：采用20mg/kg/d的ISO连续腹腔注射三天,建立BALB/c小鼠急性心肌缺血模型。小鼠分为四组：正常对照组(C组)、心肌缺血组(MI组)、心肌缺血加阴性质粒处理组(PCN组)和心肌缺血加EH-R质粒处理组(EH-R组)。利用前面实验中构建好的靶向sEH基因的特异性小干扰RNA质粒EH-R,来下调小鼠sEH基因的表达,用心脏超声测定各组左室射血分数(EF%),左室短轴缩短率(FS%),舒张末期内径(LVEDd)等的变化。取心肌组织进行HE染色,观察各组心肌组织缺血坏死的变化情况；Western blotting法检测各组心肌组织Bc1-2、Bax和sEH的表达变化。结果：与正常对照组相比,各心肌缺血组的心肌组织Bax表达升高,而Bc1-2表达下降(P<0.01)；并且心肌组织缺血坏死明显,心脏超声显示心功能受损,EF%和FS%降低,LVEDd增大。而心肌缺血加EH-R质粒组(EH-R组)与MI组和PCN组相比较,心肌组织的sEH和Bax的表达降低,Bcl-2表达升高；心肌缺血坏死明显减轻,心脏超声显示：EF%、FS%升高,LVEDd减小(P<0.01)。结论：应用RNAi技术可下调小鼠体内sEH的表达,从而相对增加心肌组织内抑凋亡基因Bcl-2的表达,缓解ISO诱导的急性心肌缺血坏死和心功能不全。