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胚胎干细胞因其具有体外自我更新以及多向分化的能力,成为研究基因功能、细胞治疗和组织再生等的有力工具。近年来,随着胚胎干细胞技术的发展及临床研究不断取得新的突破,胚胎干细胞在再生医学领域的价值越来越为人们所重视。1981年科学家们第一次通过饲养层体系实现了小鼠胚胎干细胞的分离以及体外培养。胚胎干细胞体外培养体系经历了一个漫长的发展阶段。2008年小鼠胚胎干细胞的N2B27+2iL培养体系被广泛应用,现己成为大多数实验室培养小鼠胚胎干细胞的首选。尽管这种培养体系可以使小鼠胚胎干细胞在体外很好地维持克隆形态以及多能性状态,但N2B27成分复杂,且成本过高；在不影响培养效果的同时简化培养液成分,使其组分更加明确,相应降低培养成本是一个重要研究方面。随着基因编辑技术的发展,使得包括干细胞在内的多个领域有了突破性的进展。从ZFNs到TALENs,再到CRISPR/Cas9;从最初由蛋白进行识别到核酸酶的识别,基因编辑技术的发展日新月异。近年来,CRISPR/Cas9技术的发展使得基因编辑研究进入了一个新的时代。它利用sgRNA对DNA特定位点的识别以及Cas9蛋白的DNA酶活性,使DNA双链产生断裂。DNA双链的断裂诱导细胞启动同源重组机制的基因自我修复,使得基因敲除和基因重组的效率大大提高,为科学研究提供了新的技术平台。本论文拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了Nanog-EGFP小鼠胚胎干细胞系,并以此为报告系统对于N2B27中有效的培养成分进行筛选。利用荧光显微镜观察,流式细胞术分析以及高内涵细胞成像系统分析等方法,我们观察到N2B27培养液中某些成分对维持胚胎干细胞多能性具有的重要作用。研究发现,胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺以及亚硒酸钠这五种成分浓度的降低,不利于胚胎干细胞干性的维持；另外Neurobasal作为最为基础的培养液之一,可能与这五种成分中的某一种共同作用,维持胚胎干细胞克隆形态。本论文不仅对研究小鼠胚胎干细胞多能性提供了新的技术平台和研究思路,对于胚胎干细胞的临床应用也具有指导意义。