研究背景在过去的几十年中,肥胖已成为全世界的主要流行疾病之一,尤其是在发达国家。肥胖被定义为脂肪的异常或过度积聚,与糖尿病、心血管疾病和某些类型的癌症的风险增加有关。脂质代谢紊乱是引起肥胖相关合并症的根本原因。在肥胖和2型糖尿病中,心肌细胞中饱和脂肪酸如棕榈酸(palmitic acid,PA)的过量积累可导致心肌功能障碍和心肌细胞凋亡,这种心脏损害称为脂毒性心肌病。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是细胞有氧代谢的产物,也是许多信号通路中的关键第二信使。正常机体状态下,ROS的产生与清除能够维持一定平衡。然而,在某些病理条件下,由于在线粒体中FA的氧化不充分导致体内产生大量ROS,进而对细胞大分子如脂质、蛋白质和DNA造成直接或间接损害,导致细胞凋亡及组织损伤,最终导致脂毒性心肌病的发生。自噬是真核细胞内的大分子物质及功能失调的细胞器通过溶酶体降解的过程,也是一个非选择性摄取营养的适应性反应过程。自噬在基础条件下维持细胞稳态,并在调节应激过程中的细胞适应性反应中起着不可或缺的作用。尽管自噬与心血管疾病的调节有关,但在PA诱导的心肌细胞脂毒性过程中,自噬在调节心肌细胞存活中的作用仍然未知。CTRP9是新发现的与脂联素高度同源的类似物。研究发现,CTRP9在肥胖、高脂血症和糖尿病心肌病的调节中具有保护作用,表明它可能在心脏的脂质毒性中发挥重要作用。但是CTRP9是否以及如何调节心脏脂质毒性尚不清楚。研究目的(1)明确PA诱导的原代心肌细胞脂毒性及对心肌细胞自噬的作用;(2)明确CTRP9对PA诱导的原代心肌细胞脂毒性及细胞自噬的作用;(3)明确自噬是否参与CTRP9对原代心肌细胞脂毒性的保护性作用。研究方法1.细胞培养及细胞处理:提取原代乳大鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRCM),将NRCMs在8%马血清和5%小牛血清的LG-DMEM中孵育48小时,随后将培养基替换为新鲜的LG-DMEM。重组gCTRP9蛋白(Aviscera Bioscience,Santa Clara,CA)预孵育6小时,然后用棕榈酸处理。在某些实验中,在收获细胞之前,将NRCM与巴氟霉素A1(BafA1,10 nM)预孵育4h。2.细胞活力测定:将NRCMs以1X105细胞/孔的密度接种在24孔板中,使用MTT测定法测定细胞活力,通过使用LDH检测试剂盒确定从细胞中的释放出来的LDH评估细胞损伤。3.细胞转染:使用转染试剂riboMONITORTM对NRCMs转染。对于RNA干扰,将NRCMs铺板并用100 nM ATG5特异性siRNA或对照siRNA瞬时转染。转染后48小时,通过蛋白质印迹分析确定ATG5的蛋白质水平。4.蛋白质印迹法(Western Blot):通过细胞蛋白裂解液裂解,提取不同刺激后的细胞蛋白,确定蛋白浓度后高温使蛋白变性。使用SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,按照相应的分子量切胶或裁膜进行湿转法转膜,封闭,一抗孵育4℃过夜,洗膜后二抗孵育1小时,洗去附着的二抗,化学发光,通过分析条带灰度值明确相应蛋白表达量。5.实时荧光定量PCR分析:处理后利用Trizol法提取细胞中的总核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA),测定提取的RNA浓度,使用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒进行逆转录反应合成互补脱氧核糖核酸(Complementary Deoxyribonucleic Acid,cDNA),再使用 TaKaRa 公司的 SYBR Green 实时定量 PCR试剂盒进行PCR反应,以测定ATG5和内参蛋白的mRNA表达情况。6.细胞ROS检测:用活性氧测定试剂盒(Beyotime生物技术研究所,江苏)测定细胞内活性氧的水平。将NRCMs与二氢二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)一起孵育,在37℃的无血清培养基中反应20分钟,然后收集在PBS中。用Rosup(50 μg/ml)处理20分钟的细胞用作阳性对照。装载探针后,使用荧光显微镜(Nikon ECLIPSETE2000-S)在2分钟内获取荧光图像。7.线粒体膜电位检测:线粒体膜电位(△Ψm)由JC-1检测,JC-1是一种选择性进入线粒体的亲脂性阳离子染料。在具有正常△Ψm的正常细胞中,JC-1自发形成带有强烈红色荧光的复合物。在线粒体膜去极化的情况下,JC-1保持其单体形式并带有绿色荧光。红色:绿色比率已用作估算△Ψm变化的工具,具体操作方法如下:除去培养基后,将细胞用PBS漂洗两次,并在37℃,5%的CO2中加入1ml新鲜培养基和1ml JC-1染色20分钟,然后除去上清液。然后将细胞用JC-1染色(1x)洗涤两次,然后加入2ml新鲜的LG-DMEM。我们使用荧光显微镜(Nikon ELIPSETE2000-S)观察并拍照。8.TUNEL检测:通过使用ApopTagPlus过氧化物酶原位细胞凋亡检测试剂盒(Millipore,Billerica,MA,美国)检测NRCM凋亡细胞。具体方法如下:NRCMs用4%多聚甲醛室温固定30分钟,对样品进行20 ug/ml蛋白酶K处理5分钟,并用PBS洗涤;然后将样品与3%H202孵育15分钟,加入平衡缓冲液后,将样品与TdT酶在37℃温育1小时;然后将样品与抗地高辛配基在室温下孵育30分钟。用过氧化物酶底物检测凋亡细胞,染成红褐色,正常细胞呈绿色。9.GFP-mRFP-LC3双标腺病毒评估自噬流:通过对mRFP和GFP点的计数来评估自噬。mRFP对溶酶体酸有抵抗力,而GFP没有。因此,GFP荧光仅反映尚未被溶酶体融合的自噬体,mRFP荧光反映了尚未被溶酶体融合的自噬体及与溶酶体融合的自噬体(自噬溶酶体)。10.统计学分析:实验所得数据均以均数±标准误表示,采用SPSS软件进行统计分析,多组之间的统计分析采用单因素方差分析,P<0.05代表统计学有显著性差异。研究结果1.PA引起NRCMs脂毒性棕榈酸会增加NRCMs中的细胞内ROS水平并降低线粒体膜电位(△ Ψm),且呈浓度依赖性。通过LDH测定法检测不同浓度梯度的棕榈酸刺激NRCMs细胞存活情况,并设时间梯度,我们发现NRCMs存活率呈现剂量和时间依赖性的降低。免疫印迹进一步证实与对照组相比,400 μM的棕榈酸导致凋亡标记物caspase 3显著增加。2.PA诱导的自噬降解受损导致NRCMs脂毒性NRCMs用不同剂量的PA处理24小时,蛋白质印迹显示,PA以剂量依赖性方式明显增加了 NRCMs中LC3Ⅱ/Ⅰ的比例。为了确定棕榈酸是否阻断自噬体与溶酶体融合,用LC3-mRFP-GFP腺病毒转染了 NRCMs。我们发现用棕榈酸处理24小时后,在NRCMs中仅观察到黄点,这表明在棕榈酸诱导的NRCMs中,与溶酶体的自噬体融合受阻。此外,我们发现在细胞收取前的最后4小时内加入BafA1,用棕榈酸处理24h并不会显着增加LC3Ⅱ/Ⅰ的比率,进一步证实PA阻止NRCMs自噬体-溶酶体融合。通过LDH释放试验发现,自噬诱导剂雷帕霉素,改善了 PA对NRCM的细胞毒性,而自噬抑制剂BafA1进一步加重了心肌细胞脂质毒性,表明PA诱导的自噬缺陷导致了 NRCM的细胞毒性。3.CTRP9能促进NRCMs自噬流gCTRP9孵育NRCMs不同的时间,Western印迹显示,形成自噬体必不可少的ATG5持续增加,并且gCTRP9孵育2h之后LC3Ⅱ/Ⅰ的比率增加至峰值,然后下降,而P62表达持续降低,表明gCTRP9可诱导自噬小体的增加,并促进NRCMs中的自噬流。将经LC3-mRFP-GFP腺病毒转染的NRCMs孵育24小时,与对照组相比,gCTRP9处理24小时后观察到黄色荧光和红色荧光。此外,我们用Baf1A1评估自噬是否通畅。我们发现,在孵育的最后4小时内加入BafA1,gCTRP9处理24h明显增加了 LC3Ⅱ/Ⅰ的比率,这些结果提示gCTRP9可以促进NRCMs自噬流。然后我们检测了 gCTRP9是否调节PA阻断的NRCMs自噬。我们发现,在PA刺激的心肌细胞中,预处理gCTRP9 6小时,LC3Ⅱ/Ⅰ 比值明显增加,P62明显降低以及经LC3-mRFP-GFP腺病毒转染的NRCMs红色荧光蛋白显著增加。这些结果表明,gCTRP9在恢复PA诱导的阻断的NRCMs自噬中起关键作用。4.CTRP9能重建PA导致的NRCMs降低的线粒体膜电位、抑制ROS的产生,并减少PA诱导的心肌细胞凋亡JC-1染色表明,gCTRP9预先孵育后,棕榈酸触发的线粒体膜电位降低(△Ψm)已部分恢复,我们还观察到用gCTRP9预处理可减轻棕榈酸诱导的NRCM中的ROS,这表明gCTRP9可以改善棕榈酸诱导的NRCMs脂毒性。为了进一步阐明gCTRP9在棕榈酸诱导的NRCMs脂毒性的保护作用,通过蛋白质印迹法发现,gCTRP9处理可减弱不同浓度的棕榈酸诱导的NRCM中的细胞凋亡。这些结果表明,gCTRP9可以减轻棕榈酸诱导的心肌细胞脂毒性。5.ATG5敲低减弱了 gCTRP9对心肌细胞脂毒性的保护作用为了明确gCTRP9对棕榈酸诱导的心肌细胞脂毒性保护作用是否通过自噬介导,我们通过ATG5 siRNA有效抑制了自噬。通过LDH释放试验,我们发现Atg5敲低后明显降低了 gCTRP9改善的PA诱导的NRCMs细胞活力。Atg5敲低还恢复了 gCTRP9减轻的棕榈酸诱导的ROS水平。此外,ATG5敲低部分恢复了gCTRP9减轻的PA诱导的NRCMs细胞凋亡标记物Caspase 3的表达(Western blotting)和凋亡细胞(TUNEL染色)。这些结果表明,gCTRP9对心肌细胞脂毒性的保护作用取决于自噬的上调。结论(1)CTRP9能改善PA诱导的原代心肌细胞脂毒性,并促进PA诱导的受损的细胞自噬流。(2)细胞自噬参与了 CTRP9对原代心肌细胞脂毒性的保护性作用。研究背景随着肥胖和2型糖尿病人群的逐年增加,与脂毒性相关的心血管疾病引起人们普遍关注。心肌游离脂肪酸(free fatty acid,sFA)的摄入和利用的失调可导致心肌脂质大量积聚,进而出现心肌功能障碍,引起脂毒性/肥胖性心肌病(lipotoxic cardiomyopathy)。脂质通过何种机制导致心肌功能的改变以及如何来干预脂毒性/肥胖性心肌病成为当今心血管领域的热点及难点。研究发现,脂毒性/肥胖性心肌病主要由以下发生机制:(1)脂肪组织产生的脂肪因子如瘦素及抵抗素及甘油三酯聚积可诱导心脏功能紊乱;(2)心肌细胞饱和脂肪酸的过度聚积,可引起细胞代谢紊乱及在此基础上产生的氧化应激、内质网应激,进而诱发线粒体损伤、钙稳态失调等,引起心肌结构改变、功能障碍及凋亡增多,最终导致脂毒性/肥胖性心肌病。其中,氧化应激及内质网应激诱导的凋亡在脂毒性/肥胖性心肌病中起到关键作用。脂联素是经典的内源性保护因子,虽然APN在心血管疾病中具有公认的保护性作用,但距其成为一个理想的治疗靶点仍存在很多局限性:APN主要由脂肪组织产生,其由心脏组织产生并分泌到循环中的量极低;此外APN基因敲除的动物在生理情况下没有明显的表型改变,提示体内存在某些代偿机制。而CTRP9是一种新型的脂肪细胞因子,为肿瘤坏死因子相关蛋白超家族(CTRP)成员之一,是与APN相似度最高的同源异构物。CTRP9在调节代谢、保护心肌、舒张血管及改善内皮舒张功能等方面发挥重要作用。CTRP9在心脏组织的表达量约为APN的100倍,其在心脏组织中经历溶蛋白性裂解这一转录后修饰,裂解为有活性的球状结构域形式(gCTRP9),并分泌到心脏局部组织以及循环系统中。研究显示CTRP9的生物利用度高,可能在心血管疾病中发挥较APN更为重要的生理学作用。此外,研究发现CTRP9基因敲除小鼠表现出明显的肥胖及胰岛素抵抗;过表达CTRP9可改善高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性。上述研究提示CTRP9可能通过调节脂代谢减轻脂毒性心肌损伤,但CTRP9对参与肥胖性/脂毒性心肌病的心肌细胞的作用和机制目前均不明确。解决该科学问题是推动CTRP9向肥胖性/脂毒性心肌病临床防治转化的关键。AMPK是哺乳动物细胞中能量平衡的主要细胞传感器。肝激酶B1(LKB1)可以作为AMPK的主要上游激酶并在Thr172磷酸化AMPK。在正常生理条件下,LKB1主要位于细胞核中。在某些条件下,LKB1在Ser428(pLKB1)处被磷酸化,然后转移到细胞质中,随后诱导AMPK的活化。尽管有证据表明饮食诱导的肥胖症小鼠心脏中AMPK磷酸化减弱,但尚未完全阐明降低AMPK磷酸化的机制。研究发现CTRP9与脂质代谢存在密切的联系,但CTRP9能否在高脂饮食诱导的心脏肥大和脂质毒性中起到保护作用尚不清楚。本研究主要以棕榈酸刺激原代乳大鼠心肌细胞及高脂喂养的小鼠为研究模型,探讨CTRP9能否通过调控LKB1/AMPK通路改善肥胖小鼠心肌脂毒性,为以后CTRP9防治肥胖性/脂毒性心肌病提供理论依据。研究目的(1)体内外试验明确CTRP9对心肌脂毒性及心肌肥大的影响;(2)明确LKB1/AMPK通路是否参与CTRP9对心肌脂毒性及心肌肥大的保护性作用。研究方法1.细胞培养及细胞处理:提取原代乳大鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRCM),将NRCMs在8%马血清和5%小牛血清的LG-DMEM中孵育48小时,随后将培养基替换为新鲜的LG-DMEM。重组gCTRP9蛋白(Aviscera Bioscience,Santa Clara,CA)预孵育6小时,然后用棕榈酸处理。2.细胞活力测定:通过MTT及LDH释放试验评估细胞活力及细胞损伤。3.蛋白质印迹法:通过细胞蛋白裂解液裂解,提取不同刺激后的细胞蛋白,确定蛋白浓度后高温使蛋白变性。使用SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,按照相应的分子量切胶或裁膜进行湿转法转膜,封闭,一抗孵育4℃过夜,洗膜后二抗孵育1小时,洗去附着的二抗,化学发光,通过分析条带灰度值明确相应蛋白表达量。4.实时荧光定量PCR分析:心肌组织处理后利用Trizol法提取细胞中的总核糖核酸,测定提取的RNA浓度,使用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒进行逆转录反应合成互补脱氧核糖核酸,再使用TaKaRa公司的SYBR Green实时定量PCR试剂盒进行PCR反应,以测定胶原蛋白Ⅰ和内参蛋白的mRNA表达情况。5.细胞核及细胞质蛋白分离:将取样后的细胞立即进行细胞核及细胞质蛋白分离操作(勿冻存),具体操作详见论文Ⅱ。6.细胞ROS检测:用活性氧测定试剂盒(Beyotime生物技术研究所,江苏)测定NRCMs细胞内活性氧的水平。用二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)测定心肌组织ROS水平。7.细胞转染:下调内细胞LKB1表达时,使用LKB1慢病毒转染72h后给予后续处理。8.免疫荧光显微镜技术:接种刚提取的1x105个NRCMs于共聚焦专用小皿,给予相关处理后进行固定、封闭,依次加入一抗和二抗孵育,激光共聚焦显微镜观察LKB1在细胞内的定位情况。9.TUNEL检测:通过使用ApopTagPlus过氧化物酶原位细胞凋亡检测试剂盒(Millipore,Billerica,MA,美国)检测NRCM凋亡细胞。具体方法如下见论文Ⅰ。10.动物模型:野生型小鼠和CTRP9缺陷小鼠分离给予26周高脂饮食及低脂饮食后安乐死、取材,并进行后续心肌油红O染色、WGA染色及相关免疫组化等。11.统计学分析:实验所得数据均以均数±标准误表示,采用SPSS软件进行统计分析,多组之间的统计分析采用单因素方差分析,P<0.05代表统计学有显著性差异。研究结果1.CTRP9敲除能加重小鼠高脂饮食诱导的糖脂代谢紊乱高脂饮食26周后,与WT-NC组相比,WT-HFD组小鼠循环和心脏CTRP9 水平明显降低(P<0.05)。与WT-HFD组相比,CTRP9KO-HFD组小鼠体重及肝重量明显增加(P<0.05)。同时我们观察到,与WT-HFD组相比,CTRP9KO-HFD组小鼠葡萄糖耐量更低、胰岛素更加不敏感(P<0.05)。此外,与WT-HFD组相比,CTRP9KO-HFD小鼠的血清甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)高得多(P<0.05)。研究还发现,高脂饮食会导致TG蓄积及脂肪酸合酶、总神经酰胺的上调,CTRP9敲除进一步加重上述效应(P<0.05)。2.CTRP9敲除能加重小鼠高脂饮食诱导的心肌肥大及纤维化低脂饮食及高脂喂养26周后进行超声心动图分析。研究发现,HFD喂养可显着增加心脏肥大包括左心室后壁厚度(LVPWd)、室间隔厚度(IVSTd)(P<0.05),但不会引起心脏收缩功能障碍(P>0.05)。与WT-HFD组相比,CTRP9KO-HFD组小鼠LVPWd及IVSTd明显增加(P<0.05),提示心肌肥大明显加重。WGA染色及心脏重量与胫骨长度之比结果进一步得到验证(P<0.05)。研究还发现,与WT-HFD组相比,CTRP9KO-HFD组心脏纤维化明显加重(P<0.05)。3.CTRP9敲除加重了小鼠高脂饮食诱导的心肌内质网应激相关的凋亡蛋白免疫印迹显示,与WT-HFD组相比,CTRP9KO-HFD组心肌组织GRP78、CHOP、cleaved caspase 12、cleaved caspase 3 及 PARP 表达显着增加(P<0.05)。与蛋白印迹结果一致,免疫荧光显示与WT-HFD组相比,CTRP9KO-HFD组心肌组织GRP78及CHOP明显增加(P<0.05)。TUNEL染色表明,与WT-HFD组相比,CTRP9KO-HFD组心肌组织凋亡细胞显着增加。以上结果表明CTRP9敲除加重了小鼠高脂饮食诱导的心肌内质网应激相关的凋亡。4.外源性CTRP9能改善PA诱导的内质网应激相关的凋亡LDH释放试验及MTT实验研究发现,PA能诱导NRCMs脂毒性,且呈浓度依赖性(P<0.05)。蛋白免疫印迹实验通过检测凋亡指标进一步得到验证(P<0.05)。LDH释放试验表明,CTRP9能改善PA诱导的NRCMs细胞活力。蛋白免疫印迹实验发现与 PA 组相比,PA+CTRP9 组 GRP78、CHOP、cleaved caspase 12、cleaved caspase 3及PARP表达明显减弱(P<0.05)。TUNEL染色表明,与PA组相比,PA+CTRP9组NRCMs凋亡细胞明显减弱(P<0.05)。以上结果表明外源性CTRP9能改善PA诱导的内质网应激相关的凋亡。5.CTRP9敲除进一步加重小鼠高脂饮食诱导的心肌氧化应激体外实验发现,外源CTRP9减轻了 PA诱导的心肌细胞ROS的产生,且呈浓度依赖性(P<0.05)。体内实验表明,与WT-HFD组相比,CTRP9KO-HFD组小鼠心脏组织中4HNE表达明显增强(免疫组化及蛋白免疫印迹)(P<0.05)。二氢乙啶(DHE)染色结果进一步得到验证(P<0.05)。以上结果表明CTRP9能减轻脂毒性诱导的心肌氧化应激。6.AMPK参与CTRP9对心肌脂毒性的改善作用与WT-NC组小鼠相比,WT-HFD组小鼠心脏pAMPK表达明显降低,p-mTOR表达明显增加(P<0.05),这与体外实验结果一致(P<0.05)。此外,外源性CTRP9促进了 pAMPK磷酸化,且呈时间依赖性(P<0.05)。蛋白免疫印迹结果表明,AMPK阻断剂compound C在一定程度上减弱了 CTRP9对PA诱导的NRCMs凋亡的保护作用。以上结果表明,AMPK参与了 CTRP9对心肌脂毒性的改善作用。7.LKB1/AMPK通路激活在CTRP9减轻心肌脂毒性中发挥重要作用研究发现,CTRP9能增强NRCMs pLKB1表达,且呈时间依赖性(P<0.05)。慢病毒敲低LKB1明显减弱CTRP9对NRCMs pAMPK的激活(P<0.05)。LDH释放试验表明慢病毒敲低LKB1明显降低CTRP9对PA诱导的NRCMs脂毒性的保护作用(P<0.05)。通过免疫荧光染色及蛋白免疫印迹发现,CTRP9能促进细胞核LKB1向细胞质转位(P<0.05)。以上结果表明,LKB1/AMPK通路的激活在CTRP9改善心脏脂质毒性中发挥重要作用。结论(1)CTRP9敲除能加重小鼠高脂饮食诱导的糖脂代谢紊乱。(2)CTRP9敲除加重了小鼠高脂饮食诱导的心肌肥大及纤维化。(3)CTRP9敲除加重了小鼠高脂饮食诱导的心肌内质网应激相关的凋亡。(4)外源性CTRP9能改善PA诱导的内质网应激相关的凋亡。(5)CTRP9敲除进一步加重小鼠高脂饮食诱导的心肌氧化应激。(6)AMPK参与CTRP9对心肌脂毒性的改善作用。(7)LKB1/AMPK通路激活在CTRP9减轻心肌脂毒性中发挥重要作用。