作为一种泛素化分子,一氧化氮可诱导许多生物学效应,并且在肿瘤的演化和进展中也起到非常重要的作用。一氧化氮可参与多个导致蛋白发生变化的信号转导机制。并且这些蛋白的变化是浓度依赖性的。不断产生的持续剂量的一氧化氮通过激活Caspase诱导凋亡;而生理浓度或者低剂量的一氧化氮则抑制细胞凋亡。我们以往的研究也表明细胞辐射损伤抑制的产生和染色体畸变的降低可以用p53和一氧化氮的相互作用这一信号通路模式来阐述。然而一氧化氮对细胞敏感性诱导的具体机制尚不十分清楚。本课题的目的是阐明不同浓度的一氧化氮对肿瘤细胞敏感性的影响以及与其相关的可能性机制。本课题第一部分研究以人肺癌细胞为研究对象,来阐述一氧化氮在携带不同p53基因状态的细胞中对辐射诱导的细胞死亡和染色体畸变的影响以及与p53相关的可能性分子机制。p53缺如的人肺癌H1299细胞通过稳定转染wtp53和mp53基因,得到本实验使用的野生型或突变型p53细胞。X线照射前,细胞作用于不同浓度的硝酸异山梨酯(ISDN,一种一氧化氮供体)和/或羧基-2-苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(c-PTIO,一种一氧化氮清除剂)。细胞内质粒载体的稳定表达由RT-PCR和限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)法检测。细胞敏感性、凋亡、染色体畸变和γH2AX分别由克隆形成实验、Hoechst33342染色法、TUNEL染色法、染色体显带技术和流式细胞术测定。凋亡相关蛋白的表达由Western blot检测。实验结果如下:在H1299/wtp53和H1299/mp53细胞中,p53基因7号外显子RT-PCR的产物可以观察到清晰的110 bp条带。并且7号外显子用MspI或BsrI限制性内切酶特异性消化后,分别在H1299/wtp53或H1299/mp53细胞中,可以观察到清晰的70 bp条带。这表明本实验模型是成功的和有效的。在wtp53细胞中,X线辐射前作用于低浓度的ISDN(5μM),可观察到明显的辐射抑制现象以及凋亡、DNA双链断裂和双着丝粒体染色体畸变的显著降低。然而,如果c-PTIO和ISDN照射前6小时共同存在于细胞培养液中,以上这些效应几乎被彻底地抑制。然而,X线辐射前,wtp53细胞作用于高浓度的ISDN(500μM),可观察到明显的辐射增敏现象以及凋亡、DNA双链断裂和双着丝粒体染色体畸变的显著升高。此外,H1299/wtp53细胞中辐射后凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3的表达数据表明,当p53功能正常时,一氧化氮可双向性影响X线照射诱导的通过Caspase-3和Bax介导的凋亡。这可能是一氧化氮影响野生型p53人肺癌细胞辐射敏感性的一个重要原因。但是,在上述ISDN的任何浓度,所有这些现象并没有在H1299/mp53细胞中观察到。基于以上研究,在第二部分研究中,我们只选择携带野生型p53基因的人肺癌细胞做为研究对象。本研究目的是从细胞所处周期位置不同对一氧化氮敏感性影响不同的角度,去探讨不同剂量的一氧化氮对辐射诱导的H1299/wtp53细胞杀伤和染色体畸变的双向性影响。急性X线照射前6小时,细胞作用于不同浓度的ISDN或0.02 Gy小剂量预照射。细胞同步化由血清饥饿法获得。离心收集悬浮在培养液中的有丝分裂细胞,重新接种于新鲜培养液中。细胞敏感性、细胞周期分布和染色体畸变分别由克隆形成实验、流式细胞术和染色体显带技术检测。实验结果如下:主要在细胞有丝分裂后17.5小时,在急性大剂量辐射前给予低浓度的ISDN(5μM)或者小剂量的预照射(0.02 Gy)处理,可以观察到明显的辐射适应性反应,具体表现为产生辐射抑制和抑制染色体畸变的发生。这种由低浓度的ISDN(5μM)或者小剂量的预照射(0.02 Gy)诱导的辐射适应性反应伴随着G2/M期的显著性缩短(P<0.01 vs对照组)和S期的轻微延长(P<0.05 vs对照组)。另一方面,与之相反的是,也是在细胞有丝分裂后17.5小时,在急性大剂量辐射前给予高浓度的ISDN(500μM)处理,可以观察到明显的辐射增敏性效应,具体表现为产生辐射增敏和增加染色体畸变的发生。这种由高浓度的ISDN(500μM)诱导的辐射增敏效应伴随着G2/M期的显著性延长(P<0.001 vs对照组)和S期的缩短轻微(P<0.05 vs对照组)。由此可知,G2/M细胞对ISDN诱导的细胞死亡和染色体畸变是最敏感的,ISDN对细胞生存率和染色体畸变的影响依赖于细胞周期位置。由于一氧化氮在肿瘤细胞中的增敏效应受p53基因状态的影响,因此,下一步研究的目的寻找一条新的靶向型途径,通过增加一氧化氮诱导的DNA双链断裂(DSBs)来提高一氧化氮的增敏治疗效果。本研究使用的细胞:胎鼠成纤维细胞(MEF)携带野生型或缺失型DNA双链断裂同源性重组修复(HR)基因—X线修复交叉互补基因2(XRCC2)和放射敏感突变54(Rad54);非同源末端连接修复基因(NHEJ)—DNA连接酶4(Lig4)和Ku80;DNA碱基切除修复基因DNA聚合酶β(Polβ);中国仓鼠卵巢细胞(CHO)携带野生型、突变型或回复型DNA双链断裂同源性修复(HR)基因—乳腺癌易感基因2(BRCA2)。ISDN处理后,细胞敏感性和γH2AX分别由克隆形成实验和流式细胞术测定。BRCA2基因的下调通过小干扰RNA技术来获得。实验结果如下:细胞生存率相对D50值(反映细胞对一氧化氮敏感性的高低)按增长顺序排列为:BRCA2mt细胞<<< polβ-/-细胞< XRCC2-/-细胞< Lig4-/-细胞< Rad54-/-细胞< Ku80-/-细胞。这表明本实验中,BRCA2是影响一氧化氮细胞敏感性的最有效分子靶向。此外,相对γH2AX强度在一氧化氮作用后8、12、24和48小时,BRCA2突变型(BRCA2mt)细胞要明显高于BRCA2野生型和回复型(BRCA2wt和BRCA2 rev)细胞。一氧化氮作用24小时后修复24小时的相对γH2AX强度,BRCA2突变型(BRCA2mt)细胞与BRCA2野生型和回复型(BRCA2wt和BRCA2rev)细胞也存在着显著差异。流式细胞术检测γH2AX(组蛋白H2AX在丝氨酸139位点磷酸化)的结果表明BRCA2可通过修复一氧化氮诱导的DNA双链断裂来抑制细胞对一氧化氮的敏感性。而且,小干扰RNA下调BRCA2的表达可增强人肺癌H1299细胞对一氧化氮的敏感性。总之,上述结果表明,在人肺癌细胞中,低和高浓度的一氧化氮可分别诱导截然不同的辐射敏感性,Bax和Caspase-3介导的凋亡,DNA双链断裂以及双着丝粒体染色体畸变的变化,并且一氧化氮可通过p53基因表达调控来影响细胞的生存与死亡。一氧化氮对携带野生型p53基因的人肺癌细胞的这些双向性影响依赖于细胞周期位置,是G2/M期依赖性的。此外,同源性修复基因BRCA2在一氧化氮诱导的DNA双链断裂修复中起到极为关键的作用,下调BRCA2表达可能成为提高一氧化氮对一些肿瘤病人(如p53缺失)化学增敏疗效的有效措施。