免疫磁珠分离技术用于弓形虫速殖子纯化的研究

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目的在弓形虫和弓形虫病的基础和临床研究中,以及免疫诊断的抗原制备中,如何从弓形虫感染的宿主标本中快速获得高度纯化的弓形虫速殖子,尽可能去除宿主细胞成分的污染,又尽可能避免对虫体产生机械或者化学的损伤,不影响其活性与毒力显得尤为重要。目前使用的各种方法纯化产物尚有不同程度的宿主细胞的污染,或者回收率较低。因此,需要探讨一种新的纯化弓形虫速殖子的方法。用免疫磁珠分离技术分选弓形虫速殖子,以去除宿主细胞成分,并尽可能对虫体的生物学特性无不良影响,为弓形虫与弓形虫病的基础与临床研究提供技术基础。方法将采自流浪猫的心、脑、舌组织提取的弓形虫Wh3株速殖子(基因型为China1)感染小鼠,发病后提取腹腔液,无菌生理盐水离心洗涤三次后,常规方法制备速殖子可溶性抗原, BCA蛋白浓度测定法测定抗原浓度。免疫新西兰大白兔共3次,获得兔抗弓形虫多克隆抗体IgG。用弓形虫IHA间接血凝诊断试剂测定抗体效价,Protein A Sepharose CL-4B亲和层析柱纯化抗体后进行SDS-PAGE电泳鉴定抗体的纯度。用抗体包被的免疫磁珠Goat Anti-Rabbit IgG MicroBeads对小鼠腹腔液内弓形虫速殖子进行纯化,按照说明书操作并稍加改进,比较速殖子纯度、细胞清除率、虫体回收率,并进行染色镜检。用MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒进行速殖子活性检测,用酶标仪测定490nm波长各孔吸光度值。将速殖子悬液定量分组感染小鼠后,检测其毒力与感染性。结果BCA法测定抗原浓度为0.7mg/ml,纯化后IgG抗体轻链和重链分子量在25ku和50ku。用免疫磁珠分离技术纯化弓形虫速殖子后,其纯度提高到98.2%,弓形虫速殖子与小鼠细胞数量之比为53.6:1,细胞清除率为96%,虫体回收率为73.5%。磁珠分离前后速殖子及小鼠细胞瑞氏染色镜检,磁珠分离前腹腔液涂片可见速殖子和少量小鼠细胞,分离后悬液涂片可见大量速殖子,视野中小鼠细胞比例明显减少。速殖子MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒活性检测为95.6%,磁珠分离前后速殖子活性检测吸光度值差异无统计学意义,说明磁珠分选对弓形虫速殖子活性无明显影响。定量分组感染小鼠后死亡时间无显著性差异,死亡前均出现弓形虫急性感染的临床体征,腹水可见大量的弓形虫速殖子和假包囊,说明磁珠分选对弓形虫速殖子毒力无影响。结论免疫磁珠分离后的速殖子纯度、细胞清除率和虫体回收率较高,能有效的去除宿主细胞,且对速殖子的活性和毒力无影响。分离后速殖子镜检形态典型完整。本法操作简便快速,无需昂贵的仪器设备,具有较大的实用价值。
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