过氧化氢(H202)作为活性氧(ROS)家族中的一种主要物质,在生物体中承担着从毒性物质、免疫中间产物再到信号分子的角色。化学家们已经设计了许多光电化学/传感装置,从不同的角度研究了生物体和细胞中H202的产生,及其在生理和病理学中的作用,但要实现生物体中内源性H202快速、实时、灵敏、原位检测仍然是一个挑战。主要原因是:(1)生物体中氧气绝大多数用于有氧呼吸作用,用于产生活性氧的氧气只占到1%-2%,因此H202在生物体中浓度非常低;(2)生理条件下H202从产生到分解的时间短,很难进行直接定性和定量;(3)定量细胞因子或增长因子刺激后信号通路中产生的H202非常重要,但目前的探针方法限于单色响应。尽管现有的含有单硼酸酯识别位点的探针已经能够成功检测内源性H202的存在,但许多生理通路中H202含量非常少,难以进行定量检测。为了解决上述H202检测中存在的科学问题,本论文首先合成含有H202识别位点苯硼酸酯功能化的部花菁探针,通过优化识别位点对位的取代基使探针响应时间缩短,实现对H202的快速检测。其次,将前述筛选得到的、性能优良的硼酸酯功能化的部花菁探针(BMC3)用作靶向激活位点和双发射荧光体,制备了基于双光子石墨烯量子点(TPGQD420)的比率型探针,TPGQD420-BMC3,实现对通路中的H2O2进行比率检测和定量。再次,合成基于H2O2诱导信号放大的纳米胶束探针,PMPC-Bpe@amylose,进行灵敏、可视化识别H202相关疾病,并成功应用在组织活检中。最后,制备了纳米胶束探针,PMPC-Bpe-BHQ2@SQ,利用原位级联信号放大对细胞通路中低含量的H202进行高灵敏检测。本论文主要研究内容具体如下:1)苯硼酸酯功能化的部花菁探针设计及H202的快速识别与检测现有H202识别探针在响应时间上远远超过了体内H202的寿命。传统硼酸酯用于H202的生物学检测中,其探针分子与H202响应速度非常慢,难以实现实时快速检测和定量。因此,我们首先设计多种在硼酸酯识别位点的对位含有不同取代基的部花菁探针BMCs。通过密度泛涵理论计算(DFT)及BMCs与H202反应的动力学和热力学研究,发现当H202识别位点对位由给吸电子基团变为强吸电子基团的时候,响应时间会从两小时左右缩小到十五分钟。通过取代基优化,大大加快了探针的响应速度。2)激活式双光子石墨烯量子点比率成像活体中的H202发展双光子纳米探针并将其应用于成像生物体中各种疾病相关的物质是非常有意义的。然而,现阶段纳米探针设计局限于单色荧光变化,使其难于定量检测。为解决这一科学问题,我们设计了一种双发射、双光子石墨烯量子点探针(TPGQD420-BMC3)并用于H202荧光比成像。为特异性识别H2O2并点亮TPGQD420的荧光,利用前述筛选得到的、性能优良的硼酸酯功能化的部花菁探针(BMC3)用作靶向激活位点和双发射荧光体。在740 nm的双光子激发下,TPGQD420-BMC3与H202作用时呈现出绿到蓝的比率型荧光发射,其斯托克斯位移为110 nm。经过测定纳米探针对H202的检出限下为0.05 μM、检出范围为0.2-40 μM。随后通过双光子比率成像活细胞和小鼠0-600 μm腹腔深层组织中内源性H202来验证该方法的可行性。据我们所知,这是第一次通过对GQDs的荧光进行调控从而实现双发射、双光子纳米荧光探针构建,并将这种探针应用于活体生物成像中。3)H202诱导的信号放大用于可视化组织活检H2O2作为一种潜在的疾病诊断指标,它在肿瘤的发生和原癌基因的转移等方面起着重要的作用。因此,检测组织中的H202的量对疾病识别非常重要。本节设计、合成了一种H202响应的纳米聚合物胶束PMPC-Bpe,并应用于组织活检。PMPC-Bpe包载淀粉,形成H202诱导信号放大的纳米胶束探针,PMPC-Bpe@amylose。当探针滴加到组织切片上时,组织中内源性的H202切断胶束疏水端的识别位点硼酸酯键,使疏水端变为亲水性的羧基,打破胶束亲疏水平衡使胶束破裂,从而释放出探针中包裹的大量的淀粉。在遇到外加的KI/I2,病变组织变蓝。通过变蓝的程度就可以直观的指示组织中H202的含量,从而实现潜在指标识别组织活检和方便快捷对该潜在指标相关的生理疾病进行指示。4)借助生物体原位信号放大超灵敏检测细胞内H202产生H2O2在生理信号通路中其含量非常少,传统识别内源性的H202探针很难对其的产生进行准确的荧光成像及定量。因此,本文设计了一种基于原位生物分子级联信号放大的聚合物胶束纳米探针,PMPC-Bpe-BHQ2@SQ,以期实现可视化NADPH过氧化物酶(Nox)介导的增长因子信号通路中H202的产生。由于BHQ2的吸收与SQ荧光发射有很高的光谱重叠度,因此在聚合物的疏水端共价修饰广谱猝灭剂BHQ2后,形成包裹染料SQ的探针具有极低的背景荧光。在H202存在下切断胶束疏水端的识别位点硼酸酯键使疏水端变为亲水性的羧基,打破胶束亲疏水平衡使胶束破裂,从而使包裹在胶束里面的SQ染料释放荧光初步增强。接着,如果在生物体复杂环境中释放出SQ染料,由于这种染料特殊性,它会与环境中的生物大分子、蛋白质等相互作用,使荧光进一步增强。经过两次放大和内饰猝灭剂BHQ2使胶束探针分子对H202的检出限低至纳摩尔级。从而构建出一种在复杂生物环境中原位级联信号放大策略,并通过近红外荧光成像技术将该探针成功应用在H202的来源过程监测中。据我们所知,这是第一次设计的原位级联信号放大探针用于超灵敏检测生物体刺激通路中的H202,它的出现为实现活体中原位级联信号放大提供了可能。通过以上探针的设计,成功实现了生物体中H202快速、实时和原位检测。但H202在通路中的另外一些问题,如:蛋白Cys残基氧化和它在氧化还原生物学中的作用仍然缺乏有力的化学工具进行研究。蛋白亚磺酸的氧化、还原作为一种非常重要的细胞信号传导方式,因此未来需要设计一种新型亲核体高活性、高选择性的研究H202对蛋白中亚磺酸转化的过程中执行的信号传导功能。不同信号传导过程中都有产生H202的能力,并且与诸多的生物学通路和生物系统相关,因此,未来值得去利用新型的光学纳米探针工具去探寻这种生体中重要的ROS对蛋白功能的调控。