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背景:胃癌是一种最常见的恶性肿瘤之一。与日本、韩国等胃癌高发国家相比,我们国家胃癌患者的早期诊断和早期治疗比例仍然偏低,大多数患者就诊时已处于肿瘤晚期,失去了手术切除的机会,姑息性化疗是唯一的治疗手段。质子泵抑制剂（Proton pump inhibitors,PPI）作为抑酸药物,在临床尤其是消化科临床应用非常广泛,是治疗酸相关疾病例如反流性食管炎GERD的首选药物。实体肿瘤的代谢具有一大特征,即使在氧供应充足的情况下,也采用糖酵解的代谢途径,而糖酵解的产物是乳酸,这样势必造成实体肿瘤处于酸性的微环境。先前的研究又表明,肿瘤的酸性微环境对其侵袭转移的恶性行为以及耐化疗药物都具有重要作用,那么逆转肿瘤的酸性微环境可以在多方面为抗肿瘤提供益处。PPI在肿瘤治疗尤其是胃癌的治疗方面已经有不少文献报道其具有潜在的应用价值。阐述PPI对肿瘤细胞生物学行为的影响,拓展PPI与各种临床试验用药的联合作用,将极大开发PPI在肿瘤治疗中的应用范围,同时也可以提升原来各种治疗的疗效。目的:本研究基于前期各项结果,对PPI具有的各种对肿瘤细胞生物学行为（包括自噬、凋亡）的影响进行分析,回溯PPI导致这些变化的上游原因,以找到PPI抗肿瘤的普遍规律,例如对蛋白酶体功能的影响,对内质网应激反应的诱导,引起线粒体凋亡的关键途径等等。再基于这部分结果,寻找可能存在的和PPI具有联合作用的靶点,例如蛋白酶体抑制剂Bortezomib和线粒体抗凋亡蛋白Bcl-xl抑制剂ABT263/ABT737,这两个药物都是已经进入临床或者在进行临床试验的药物,进而探究PPI与其联用的效果和相关的机制。方法:使用 Cell Counting Kit（CCK8,Dojindo,Japan）法测定 PPI 对不同肿瘤细胞株的IC50,台盼蓝染色和PI阳性细胞染色确定PPI处理后细胞死亡的程度,流式细胞周期分析检测PPI对细胞周期的影响,确定PPI基本的体外抗肿瘤细胞的剂量和时间。使用电镜、免疫荧光、Western blotting等手段明确PPI对自噬的作用,结合RNAi干扰技术和抑制剂,筛选出在PPI诱导的自噬中起重要作用的关键分子,以及自噬在PPI抗肿瘤作用中的影响。使用Western blotting和Q-PCR联合分析PPI对自噬受体蛋白SQSTM1的调控模式,揭示其mRNA和蛋白水平的变化规律。基于自噬和SQSTM1的影响结果,探索PPI对细胞内另一个重要蛋白质降解系统泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）的影响,采用 Western blotting 检测 poly-ubiquitinated proteins 的聚积,Q-PCR 的方法检测20S各个亚基的mRNA表达情况改变。从泛素降解系统受损和自噬降解系统激活的结果出发,PPI势必会造成细胞内蛋白质堆积毒性,采用Western blotting和Q-PCR的方法检测未折叠蛋白反应的激活程度,并且通过RNAi或者抑制剂的方法揭示未折叠蛋白反应（即内质网应激）在自噬激活过程中的重要作用。无论是泛素-蛋白酶体降解系统受损还是未折叠蛋白反应造成的蛋白聚积,其对细胞的损伤程度,均与细胞自身的蛋白合成水平相关。当采用蛋白合成抑制剂Cycloheximide（CHX）或者蛋白合成减缓剂Rapamycin（Rapa）时,内质网应激反应的程度（通过Western blotting和Q-PCR的方法进行检测）会有所降低。尽管PPI能够使蛋白酶体的功能受损,诱导内质网应激反应,但是其诱导细胞死亡的方式并不是线粒体依赖的凋亡。我们通过Western blotting和Q-PCR的方法,筛选线粒体Bcl-2家族（包括抗凋亡蛋白Bcl-xl,Bcl-2和Mcl-1,以及促凋亡蛋白BAX,BAK1,Bim,Bik等）中受到PPI处理影响的成员,进而与相应的抑制剂例如Bcl-xl抑制剂ABT263/ABT737联合作用,探索其联合作用的效果,并分析可能存在的机制。结果:CCK8,台盼蓝染色和PI阳性细胞染色均明确提示PPI对于体外肿瘤细胞具有明显的抗肿瘤作用和促凋亡作用,流式细胞周期分析提示PPI能够使不同p53状态的细胞阻滞于G2/M期。电镜、免疫荧光、Western blotting等手段明确PPI对自噬体的形成具有重要作用,并且这种作用依赖于Atg5/Atg7而非Beclin 1。虽然之前有很多研究报道PPI可能会抑制除H+-K+-ATPase外的其它质子泵,例如V-ATPase（空泡型质子泵）,但是我们采用LysoTracker Red染色和GFP-mRFP-LC3B腺病毒荧光观察,均未见自噬流的阻滞。鉴于PPI促进自噬体形成同时又不阻滞自噬流,那么PPI所导致的SQSTM1的聚积,可能是源于其mRNA的升高。通过Q-PCR分析,我们发现PPI处理之后在不同细胞中均有SQSTM1的mRNA升高,并且这种升高是由Nrf2这个转录因子介导的。为了避免mRNA升高对SQSTM1在PPI处理下变化原因的探索,我们采用外源性过表达的方式,发现PPI处理能够使得外源性的HA-SQSTM1升高,考虑到SQSTM1的降解还依赖于泛素系统,因此这一结果提示PPI可能对泛素-蛋白酶体系统有抑制作用。使用Western blotting和Q-PCR联合分析发现,PPI能够诱导poly-ubiquitinated proteins的聚积,并且对20S各个亚基的mRNA表达水平有不同程度的抑制作用。伴随着PPI导致的细胞内蛋白质堆积毒性,Western blotting和Q-PCR均提示有未折叠蛋白反应的激活,即内质网应激反应,通过RNAi或者抑制剂的方法发现未折叠蛋白反应（即内质网应激）在自噬激活的过程中起重要作用。当采用蛋白合成抑制剂Cycloheximide（CHX）或者蛋白合成减缓剂Rapamycin（Rapa）时,内质网应激反应的程度会有所降低,使PPI对细胞的毒性作用丧失。通过Western blotting和Q-PCR的方法,筛选线粒体Bcl-2家族（包括抗凋亡蛋白Bcl-xl,Bcl-2和Mcl-1,以及促凋亡蛋白BAX,BAK1,Bim,Bik等）中受到PPI处理影响的成员,发现Bcl-xl有明显的上调,虽然上调的具体机制并不是很清楚,但是我们发现与Bcl-xl抑制剂ABT263/ABT737联合作用后,对细胞的杀伤程度达到了两种药物单独使用时从未到达的程度,这对拓展PPI使用的范围和增加其抗肿瘤效果具有重要意义。结论:PPI具有抗肿瘤活性,从诱导G2/M周期阻滞和引起细胞死亡两个方面得以验证。在不同的细胞株中,PPI均能够诱导自噬体的形成,但是对于自噬流的影响,不同细胞展现不同的结果,有抑制自噬流也有维持自噬流通畅的。无论在PPI维持自噬流的细胞还是阻断自噬流的细胞中,均可见SQSTM1 mRNA和蛋白的升高。进一步的研究显示,SQSTM1转录活性的增加是通过Nrf2这个转录因子介导的。除了自噬,PPI还对细胞内另外一个重要的蛋白降解系统有影响,通过降低20S各个亚基的mRNA表达水平来影响其功能,造成蛋白质聚积,引起未折叠蛋白反应,从而诱发内质网应激。通过上述的作用,PPI对细胞凋亡的诱导作用还是非常有限的,并且PPI诱导的凋亡并不是通过常见的抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl实现的。为了能够有扩大PPI的促凋亡作用,联合使用靶向线粒体膜电位稳定维持的抗凋亡蛋白Bcl-xl的抑制剂ABT263和/或者ABT737后,有显著的凋亡诱导作用产生,这提示PPI与ABT263和/或者ABT737的联合作用具有深远的应用价值。