单细胞电致化学发光检测

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先前,我们课题组研制出一种基于鲁米诺电致化学发光技术,来分析单个细胞细胞膜中活化胆固醇。该技术通过在培养有细胞的电极下面嵌入一个与细胞尺寸相仿的针孔,使得只有一个细胞暴露在检测器(PMT)上。溶液中存在的胆固醇氧化酶和细胞膜上活化胆固醇反应,产生过氧化氢,在电压的作用下促进了鲁米诺的电致化学发光;通过针孔的来自单个细胞产生的光被PMT收集,实现了单细胞分析。实验结果表明单细胞细胞膜内活化胆固醇存在较大的偏差,显示了单细胞分析的意义。这种具备针孔的电致化学发光检测设备的成本很低,操作简便;但该技术的缺点在于分析通量低,无法分析电极表面的多个单细胞,限制了分析的速度。为了克服这种弊端,我们结合微加工技术,研制出一种具备和单个细胞尺寸相当的微洞电极序列,在每个微洞电极上存在一个单细胞。胆固醇氧化酶和细胞质膜内活化胆固醇反应后,在微洞中逐渐产生过氧化氢,由于微洞的结构减慢了过氧化氢向本体溶液中的扩散。因此通过过氧化氢的产生和扩散之间的平衡,微电极表面过氧化氢在一个持续的时间段内呈半稳态分布;在这段时间内,每个微电极被依次加上一个电压脉冲,产生电致化学发光,从而实现对单个细胞的依次检测。这个装置中,单细胞检测是通过依次施加电压实现的,因此不需要针孔。这种无针孔的装置有利于测量的自动化,增大了分析量。在这个平台的基础上,我们分析了大量的单细胞,进一步的研究细胞膜内活化胆固醇的特异性。第二个项目是细胞内脂分子分析,通过把细胞浸泡在低离子强度缓冲溶液中,使细胞膜磷脂活化。细胞膜上的磷脂与溶液中磷脂酶D(或鞘磷脂酶和磷酸酶)和胆碱氧化酶的作用,在电极表面产生高浓度的过氧化氢,从而引发可测量的鲁米诺电致发光。单细胞内脂分子快速序列分析可通过我们实验室先前研制的多微电极阵列来实现。第三个项目是发展能够化学发光的碳点。碳点是一种低毒性的荧光材料,其化学发光性质尚处于研究的早期阶段。目前为了实现其化学发光,强氧化剂或者强碱需要加入到体系中,限制了该材料在生物检测中的应用。我们利用C0304纳米材料对于过氧化氢良好的催化性,发展了化学发光的新型碳点,这种新型材料检测双氧水的原理在于:过氧化氢扩散进入混合物与核中心的C0304纳米粒子反应产生氧自由基,氧自由基和周围的CDs反应产生化学发光。实验结果证明:在PH=7.4的条件下,过氧化氢的加入引起了碳点发光强度的迅速增加发光的迅速增加,该结果表明,在没有任何氧化剂和烷烃存在的情况下,复合物和过氧化氢结合就会发光。将复合材料加入细胞溶液中,该材料可以进入细胞内部,与细胞产生的过氧化氢产生化学发光现象。对比于荧光检测方法,化学发光无需激发光源,更具有应用于活体检测的潜力。
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