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目的通过检测烫伤大鼠以及艾塞那肽(Exendin-4)治疗大鼠的胰腺及胰岛细胞中的Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白(non-phosphoβ-catenin蛋白、TCF7L2蛋白、Cyclin D1蛋白)及相关m RNA,探讨严重烫伤以及艾塞那肽(Exendin-4)治疗的大鼠胰岛细胞Wnt/β-catenin信号通路的变化。方法本课题采用了7周龄的wistar雄鼠随机分成6组:假烫组(control,C)、烫伤组(scald,S)、假烫+DKK1(Dickffopf1)组(control+DKK1,CD)、烫伤+DKK1组(scald+DKK1,SD)、假烫伤+Exendin-4治疗组(control+Exendin-4,CE)、烫伤+Exendin-4治疗组(scald+Exendin-4,SE)。(1)制备烫伤模型:假烫组、烫伤组、假烫+DKK1组、烫伤+DKK1组、假烫伤+Exendin-4组以及烫伤+Exendin-4组。烫伤组、烫伤+DKK1组、烫伤+Exendin-4组大鼠在94℃水浴锅里烫伤背部12 s,腹部6s,造成50%TBSA(Total Body Surface Area)III°烫伤,烫伤大鼠消毒后均腹腔注射生理盐水4ml/100 g;假烫组、假烫+DKK1组、假烫+Exendin-4组大鼠在相同部位于37℃温水中浸浴相同时间,做实验对照组。烫伤+DKK1组、假烫+DKK1组大鼠予以腹腔注射DKK1(1μg/kg/d,1次/天,共3天),烫伤+Exendin-4组、假烫+Exendin-4组大鼠腹腔注射Exendin-4(4μg/kg,2次/天,共3天),烫伤组、假烫组腹腔注射等量灭菌注射用水(1次/天,共3天)。伤后3天(即72小时)进行后续实验。(2)剪尾法检测空腹血糖。(3)收取腹主动脉血清,Elisa法测定血清的胰岛素水平。(4)进行腹腔糖耐量实验,记录空腹血糖,记录注射葡萄糖后5 min、15 min、30 min、60 min、90 min以及120 min的血糖值,绘制血糖-时间曲线并计算曲线下面积。(5)称取胰腺组织湿重,在60℃烘箱中烘烤72小时后再测量其干重,计算干湿重比以及水肿指数。(6)对胰腺组织进行免疫荧光染色,观察胰岛素、non-phosphoβ-catenin蛋白以及TCF7L2蛋白的定位情况。(7)运用消化酶法提取胰岛细胞,对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白(non-phosphoβ-catenin蛋白、TCF7L2蛋白、Cyclin D1蛋白)进行免疫印迹检测(Western Blot)。(8)对所提胰岛中前胰岛素原、β-catenin以及TCF7L2的m RNA转录情况进行RT-q PCR检测。结果1.大鼠烫伤前后空腹血糖变化:烫伤后血糖以及烫伤前后血糖差与假烫组相比烫伤组、烫伤+DKK1组、烫伤+Exendin-4组大鼠空腹血糖明显升高血糖差值明显增大;与假烫+DKK1组相比烫伤+DKK1组大鼠空腹血糖明显升高血糖差值明显增大;与烫伤组相比烫伤+DKK1组大鼠空腹血糖明显升高血糖差值明显增大;与假烫+Exendin-4组相比烫伤+Exendin-4组大鼠空腹血糖明显升高血糖差值明显增大;与烫伤组相比烫伤+Exendin-4组空腹血糖下降血糖差值减小。2.大鼠血清胰岛素浓度:与假烫组相比烫伤组、烫伤+DKK1组、烫伤+Exendin-4组大鼠血清胰岛素浓度增高;与假烫+DKK1组相比烫伤+DKK1组大鼠血清胰岛素浓度增高;与烫伤组相比烫伤+DKK1组大鼠血清胰岛素浓度增高;与假烫+Exendin-4组相比烫伤+Exendin-4组大鼠血清胰岛素浓度增高;与烫伤组相比烫伤+Exendin-4组大鼠血清胰岛素浓度明显增高。3.大鼠IPGTT时间-血糖曲线下面积:与假烫组相比较烫伤组、烫伤+DKK1组与假烫组、假烫+DKK1组、假烫+Exendin-4组、烫伤+Exendin-4组大鼠相比时间-血糖下面积明显增大。4.大鼠胰腺组织水肿指数:与假烫组相比烫伤组、烫伤+DKK1组、烫伤+Exendin-4组大鼠胰腺组织水肿指数明显增大;与假烫+DKK1组相比烫伤+DKK1组大鼠胰腺组织水肿指数明显增大;与烫伤组相比烫伤+DKK1组大鼠胰腺组织水肿指数明显增大;与假烫+Exendin-4组比烫伤+Exendin-4组大鼠胰腺组织水肿指数明显增大;与烫伤组相比烫伤+Exendin-4组大鼠胰腺组织水肿指数减小。5.大鼠胰腺组织胰岛素、non-phosphoβ-catenin蛋白、TCF7L2蛋白的免疫荧光分布情况:胰岛素主要位于胰岛细胞中,non-phosphoβ-catenin蛋白多位于细胞膜,TCF7L2蛋白位于细胞核。6.大鼠胰岛细胞Wnt/β-catenin信号通路Western Blot结果相关蛋白含量的变化:Non-phosphoβ-catenin蛋白、TCF7L2蛋白:与假烫组相比较烫伤组、烫伤+DKK1组、烫伤+Exendin-4组表达减少,与烫伤组相比较烫伤+DKK1组表达减少,与假烫+DKK1组烫伤+DKK1组表达减少,与假烫+Exendin-4组相比较烫伤+Exendin-4组减少、与烫伤组相比较烫伤+Exendin-4组增多;Cyclin蛋白表达与假烫组比较烫伤组、烫伤+DKK1组减少,烫伤+DKK1组表达较烫伤组减少,烫伤+DKK1组表达较假烫+DKK1组减少。7.大鼠胰岛细胞Wnt/β-catenin信号通路RT-q PCR结果相关m RNA含量的变化:β-catenin、TCF7L2及前胰岛素原:与假烫组相比较烫伤组、烫伤+DKK1组表达减少,与烫伤组相比较烫伤+DKK1组表达减少,与假烫+DKK1组烫伤+DKK1组表达减少;β-catenin、TCF7L2:与烫伤组相比较烫伤+Exendin-4组增多;与假烫+Exendin-4组相比较烫伤+Exendin-4组较减少。结论1、Wnt信号通路活性降低可能是严重烫伤后大鼠胰岛β细胞功能损伤,胰岛素转录、分泌功能下降,导致糖代谢障碍的分子机制;2、Exendin-4可能通过增强胰岛Wnt信号通路活性,上调TCF7L2表达,促进下游胰岛素转录及分泌增加,从而改善严重烫伤后大鼠糖代谢障碍。