肺的免疫防御系统是机体最易于受到病原微生物攻击的原发性防御体系，肺内的原发性防御包括结构上的防御，气道内的抗微生物体分子防御以及由局部肺泡巨噬细胞和炎症后聚集到肺内的多聚核白细胞(PMNs)提供的吞噬性防御。肺的原发性抗微生物体防御主要是肺上皮细胞，局部肺泡巨噬细胞和原发性免疫系统的蛋白质组分。过去10年来的研究提供了充分的证据表明，肺泡腔中的表面活性物质组分肺泡表面蛋白A(SP-A)作为肺内原始的内源性的免疫调节剂发挥着重要的作用。位于肺的液气交界面的肺泡表面活性物质由大约90％的脂质和10％的蛋白质组成，脂质中90％为磷脂，主要(75％)是二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)使得肺泡呼气末表面张力较小。蛋白质组分中包含水溶性的表面蛋白A(Surfactant protein A，SP-A)和SP-D，以及脂溶性的SP-B和SP-C。SP-A的结构、分布和特性使得人们预期它的功能主要在于肺泡膜的形成和肺泡表面张力的减少，但是SP-A-／-鼠的研究却并不能肯定SP-A在表面活性物质代谢中的主要作用，这些基因缺陷鼠的呼吸功能大多正常而对许多病原微生物的易感性较之野生型鼠却大为增加，这些结果充分说明SP-A的主要功能在于调节肺的免疫反应。 细菌内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)是最早明确的SP-A的特异性配体之一，离体研究表明无LPS的SP-A不仅抑制了LPS诱导的细胞反应，而且增加了细胞对LPS的去乙酰化和清除。后者被认为有助于免疫细胞对LPS的解毒作用。更重要的是，SP-A-／-鼠较野生型鼠在LPS刺激后支气管内产生更多的TNF-α和NO，气管内给以外源性的SP-A则能纠正这些野生型鼠对LPS的反应。这些离体和在体的研究结果都强有力的提示了SP-A在调节LPS诱导的细胞反应中起着重要的作用。本实验研究着重探讨了SP-A的抗炎性作用与LPS诱导的NF-κB／IκB-α信号转导通路之间的关系。 首先，本研究结果表明就基础状态下TNF-α的释放和NF-κB的活化而言，SP-A对细胞没有刺激作用。Western印迹法显示SP-A剂量依赖地增加了IκB-α的基础水平，由于中等量的IκB-α增加即足以使核内p65再分布到胞浆内，因此SP-A导致的NF-κB 浙江大学博士学位论文一9-活化抑制很可能是IKB一a增加的结果。SP一A对NF一KB的影响在转染CD14和TLR的CHO细胞上也得到确认，流式细胞仪分析转染细胞膜表面CD25表达的结果说明TLRZ和TLR4都不是SP一A的应答性配体。上述结果强烈的提示本实验中所用的SP一A无内毒素和脂肤的污染。 其次，本研究发现SP一分别抑制了肺泡巨噬细胞内R-以及S一LPS诱导的细胞活化。在LPS刺激下，对照组细胞的胞浆IKB一。在30一40分钟左右迅速降解，1小时左右再度出现，而在SP一A预处理的实验组，胞浆IKB一。显著增加并提前再度出现。最新的研究发现IKB一a的抑制作用不仅仅是把NF一KB滞留在胞浆中，而且在核内阻止NF一KB与特异性DNA序列结合并将核内NF一KB运回到胞浆中。由此作者认为SP一A通过增加IKB一a蛋白而下调NF一KB依赖的基因表达成为可能。既然SP一A对R一LPS和S一LPS诱导的细胞反应均有明显的抑制，R一LPS能与SP一A相结合的;而S一LPS不是SP一A的配体，因此SP一A的抑制作用看来不依赖于LPS与SP一A的结合程度，而更可能是与肺泡巨噬细胞直接作用而产生的。 对于SP一A抑制LPS诱导的细胞活化的机制最近才开始研究。SP一A介导的胞内IKB一a蛋白增加可能是由于蛋白质合成的增加，或者是降解的减少，或者是影响了蛋白质在胞内的再分布。因为IKB一a基因本身是NF一KB转录依赖的，以前多个研究和本研究均未能发现SP一A自身导致NF一KB活化，并且蛋白合成抑制剂CHX和Rl’- PCR的结果均未能发现SP一A在转录水平上影响IKB一a，因此SP一A对IKB一a的影响可能发生于转录后和/或翻译后水平。据最近的文献报道，信号依赖的IKB一a逆转是磷酸化介导的，本实验中sP一A对LPs诱导下IKB一a的积聚也是通过影响其诱导性的丝氨酸磷酸化而产生。在LPs刺激下，sP一A预处理导致了IKB一a的丝氨酸磷酸化明显抑制而其上流激酶IKK则增加。有意义的是SP一A本身并不影响IKB一a的丝氨酸磷酸化，值得注意的是，除了丝氨酸磷酸化，IKB一a还有几个其他的磷酸化位点，其中升r42的酪氨酸磷酸化据报道可以抑制其诱导性磷酸化。通过免疫沉淀，本研究结果证实SP一A能快速的、时间依赖的诱导了肺泡巨噬细胞内IKB一a的酪氨酸磷酸化，显然其具体磷酸化的位点还有待与进一步阐明。到目前为止，SP一A自身的信号通路有很多方面仍不了解，尽管有数个细胞表面蛋白被认为是SP一A的可能受体，我们还不能排除SP一A作用于细胞膜上受体 浙江大学博士学位论文一10-而产生全面的胞内抑制性信号，而IKB一a的酪氨酸磷酸化只属于其下游事件的这一可能性。另一方面，有报道大约55%膜结合的SP一A能快速的被肺泡巨噬细胞内吞，因此在进入肺泡巨噬细胞以后，SP一A还有可能通过蛋白质一蛋白质之间的相互作用修饰IKB一a蛋白，从而阻止其诱导性?